腺病毒载体AD-BDNF-EGFP的构建和在神经干细胞中的表达

发布时间：2019-07-18 08:04

【摘要】： 随着现代交通以及建筑的发展，脊髓损伤(spinal cord injury SCI)患者的数量与日俱增。外伤性的脊髓损伤危害严重，常导致截瘫。包括外科手术、药物治疗等在内，，很多方法正在用于治疗脊髓损伤，恢复患肢功能。神经干细胞(NSCs)移植是一种新的治疗方法，植入的细胞可以替代受损区域的细胞，促进神经元回路的重建，恢复脊髓功能。本研究是通过分子生物学技术，在体外构建整合有BDNF基因的腺病毒载体，感染体外培养的脊髓神经干细胞，诱导细胞向神经元分化。为以后干细胞体内移植治疗脊髓损伤提供实验依据。第一部分脊髓源性性神经干细胞的培养与分化目的探讨大鼠脊髓源性胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化，为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14～16d的SD大鼠胚胎脊髓在条件培养基中培养增殖传代分化，用神经干细胞特异性抗体—巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞，用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。用Brdu免疫荧光对神经干细胞传代能力检测。结果获得了大量能自我增殖并分化的细胞，分化后主要产生神经元特异性微管相关蛋白(MAP-2)染色阳性的神经元质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性的星行胶质细胞和少突胶质细胞的神经干细胞。Brdu免疫荧光显示神经球中绝大多数细胞为Brdu阳性细胞，其细胞核中可见荧光标记物。结论该种方法培养的细胞：①具备生长因子反应性，即只有在碱性成纤维生长因子的存在下方可表现出增殖能力并形成所谓的“神经球”样悬浮小体；②可在体外传代并维持增殖活性；③神经球内的大多数细胞为nestin阳性；④来自一个神经球的细胞可分化产生3种主要的神经细胞，即培养细胞具有多向分化的潜能。因而本研究培养的细胞具备了神经干细胞的基本特性，为接下来的实验提供基础。第二部分腺病毒载体Ad-BDNF-EGFP的构建和在神经干细胞中的表达目的腺病毒载体Ad-BDNF-EGFP的构建和在神经干细胞中的表达情况的检测。方法通过RT-PCR成功从在大鼠的海马中获得BDNF基因，通过基因克隆以及HEK293包装，获得了含增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组腺病毒表达载体pAd-BDNF-EGFP，将其感染原代培养的神经干细胞，观察EGFP及BDNF两种基因的表达，镜下测定转染率，并对RT-PCR产物检测证实BDNF的存在。转染后的神经干细胞经G418筛选，抗性细胞传代扩增后获得成功转染BDNF基因的NSCs克隆。结果荧光显微镜下可见感染后的NSCs表达EGFP而发出绿色荧光；通过RT-PCR证明感染后的NSCs具有表达BDNF的能力；用ELISA鉴定细胞上清中分泌的BDNF 72h的含量达到最高，为11.68ng／ml；证明通过构建病毒的感染可以使神经干细胞获得分泌BDNF的能力，并且EGFP基因可作为神经干细胞移植研究中良好的示踪剂。结论腺病毒病毒介导EGFP基因以及BDNF基因在大鼠胚胎神经干细胞中成功表达，为我们应用分子生物学、基因技术，以神经干细胞直接作为基因靶细胞，介导基因治疗中枢神经系统疾病莫定了一定基础。
文内图片：

图片说明：NSCs72h后球形悬浮生长100X)
文内图片：

图片说明：NSCs7211后Nestln染色(200x)
【学位授予单位】：同济大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R651.2;R346

【参考文献】