大鼠睾丸间质祖细胞的原代培养及其移植后生长情况观察

发布时间：2019-08-13 10:35

【摘要】：目的 本实验取SD大鼠睾丸间质祖细胞(progenitor Leydig cell,PLC)进行体外分离、培养、鉴定,同时制作去势大鼠模型,将经过体外培养的PLC 移植入肾包膜内,采用HE 染色、酶组织化学染色、电镜技术、MTT、RT-PCR 及磁分离均相酶联免疫(磁酶免)睾酮定量测定法等技术方法观察其在体内外生长分化情况,以期进一步探讨睾丸间质细胞(Leydig cell,LC)生长分化的机制,并为临床应用睾丸间质细胞移植治疗男性性腺功能低下症提供实验参考。 方法 1 睾丸间质祖细胞的培养 取生后17~18 天的SD 乳大鼠,无菌操作下分离得到睾丸组织,0.1%胶原酶Ⅳ34℃消化,尼龙网过滤,收集消化所得细胞悬液,低速离心,细胞沉淀用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液重悬,接种于培养瓶中,采用差速贴壁法纯化间质细胞。 培养的乳大鼠睾丸间质祖细胞采用3β羟基甾醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)组织化学染色法鉴定。常规HE 染色,通过光学显微镜观察细胞形态;制作电镜样品,通过透射电镜观察超微结构特征。采用MTT法绘制生长曲线,得出增殖活性最大的时间。应用磁酶免方 法测定不同培养时间细胞分泌睾酮含量。 2 制作去势大鼠模型并进行细胞移植 取250g 重的SD 雄性大鼠30 只,手术切除双侧睾丸及附睾(去势)。将去势后的SD 大鼠随机分组(实验组和对照组)。用1ml 注射器向实验组大鼠肾包膜下各个方向依次均匀注射预先抽取好的移植细胞悬液0.1ml(约4~5×107 个细胞);对照组在相同部位注射0.1ml 的无血清培养液以代替移植细胞悬液。 3 测定移植细胞生长状况 通过磁酶免方法,测定大鼠体内血清睾酮含量;采用RT-PCR 定量检测促黄体生成素受体(luteinizing hormonereceptor, LHR)mRNA 表达状况;记录精囊的长度和重量,精囊的重量按Boyle 介绍的公式计算相对重量=1 2两侧精囊重量(mg)×10 动物体重(g)进行结果观察。 结果 1 分离细胞及纯度鉴定 1.1 总的睾丸间质内的细胞,经过Ⅳ型胶原酶及机械法的作用,大部分间质内的细胞都已经消化下来,而曲细精管保持完整,表面光滑,基本没有断裂。 1.2 培养24h 后,活性良好的睾丸间质祖细胞大部分已贴壁,典型的呈梭形、三角形、多边形,核大,部分细胞胞质呈均匀的细颗粒状,相差显微镜下可见为细小均一的脂滴。3β羟基甾醇脱氢酶(3β-HSD)染色阳性率达68.2%以上。3~4 天后形成形态均一的细胞单层。此段时间细胞增殖旺盛,细胞
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R321

【参考文献】

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本文编号：2526065