hTERT-逆转录病毒载体构建及其介导的脐血间充质干细胞基因转移研究

发布时间：2019-09-04 19:01

【摘要】：间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是指一群具有向成骨细胞、成脂肪细胞、肝脏细胞、心肌细胞和神经细胞等多种细胞分化的多潜能组织干细胞。MSCs不仅存在于骨髓,也存在于脐血和外周血中。与骨髓相比,脐血来源更为充足,免疫原性更弱,能耐受更大程度的HLA配型不符。但是脐血中的间充质干细胞含量较低,扩增困难,对于临床的应用是很大的阻碍。因此我们试图在脐血原代培养和纯化的基础上,通过导入基因的方法,延长细胞的生长周期,为组织工程学打下基础。 延长细胞寿命甚至使细胞达到永生化的方法有很多,目前发现导入外源性人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)可以激活细胞内端粒酶的活性,该酶可使端粒长度保持恒定从而极大的扩张细胞的增殖能力,我们设想将外源性hTERT基因转入正常的细胞中,有可能激活端粒酶使细胞增殖能力增强,不易衰老甚至有可能超越细胞增殖的危机获得永生化。 然而问题是怎么把hTERT基因转入正常的细胞中?目前转基因的方法有很多包括病毒载体如逆转录病毒和腺病毒等;非病毒载体如阳离子脂质体介导法、钙离子沉淀法、电穿孔法等。方法不同,转化效率不同。脂质体转染法等效率很低,而逆转录病毒和腺病毒载体有比较高的转染效率,但腺病毒介导的外源性基因表达是暂时的,因为腺病毒DNA通常不能整合入细胞基因组。逆转录病毒能使目的基因稳定地整合于靶细胞的染色体,最终实现基因的转移,可以广泛用于高效的单一或多基因的转导,例如各种类型的原代细胞,体内细胞等。目前用逆转录病毒作为转基因的载体是最常用,效率比较高而且相对简单的方法。
【图文】：

2005年硕士学位论文hTERT一逆转录病毒载体构建及其介导的脐血间充质干细胞基因转移结果CMSCs的培养:本实验中培养了52份脐血，有14份长出了梭形细胞，描述的25%相同，而能够达到融合传代的有六份，约n%。置显微镜下观察:培养初期(24卜72h)UBCMSCs胞体小，细胞在培分布，呈圆形，培养物中造血细胞成分居多，随培养时间的延长，这逐渐坏死破碎，随换液次数的增多而清除。原代细胞培养72h换液后，贴壁细胞，此时贴壁的细胞为单个或几个细胞的克隆，细胞则呈三角，，有粗大突起伸出，以后逐渐变为椭圆，胞体变大，向两极伸出突起，此生长过程大约为d7，传代后，细胞变纯，形态不规则体积较大的细亡，以梭形为主，见图1。

感受态细菌JM109中，挑选出具有氨卞抗性的细菌克隆八个，经Bgln和Notl双酶切，琼脂糖电泳筛选，所选的质粒酶切图谱为6.Ikb和3.6kb两个片段，证明构建成功见图2。扩大培养后提取质粒，该质粒的单酶切和双酶切图谱见图3。图Zh花RT逆转录病毒载体的筛选:左一>右，marker，目的质粒，非目的质粒1，非目的2图3左一>右双酶切，单酶切，marker2.2选责稳定转导并持续表达hTERT的抗性克隆:用G418浓度为lo00m留L筛选d7后包装细胞大部分死亡，死亡细胞变为圆形，并逐渐脱落，Zw后长出克隆，待细胞克隆长至肉眼可见时将细胞克隆消化后扩大培养，挑出四个细胞克隆测病毒滴度，见图4A一B。2.3病毒滴度的测定:将病毒上清感染NIH3T3细胞
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R346

【参考文献】

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本文编号：2531940