重组人可溶性APRIL及其突变体的制备与功能分析

发布时间：2019-09-05 06:54

【摘要】：增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand, APRIL)是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的新成员之一,全长为250 个氨基酸,属Ⅱ型跨膜蛋白,通过与其受体结合而发挥生物学作用。近年研究表明,APRIL 密切参与了促进多种恶性肿瘤细胞增殖、延长恶性肿瘤细胞存活及加速肿瘤形成等多个过程。因此,该分子有望成为多种恶性肿瘤治疗时进行药物设计的新靶点,设法有效抑制APRIL 的功能活性,将有可能为相关肿瘤的治疗提供崭新途径。为此我们克隆和表达了重组人可溶性APRIL(soluble APRIL,sAPRIL)分子,在与TALL-1 ( TNF and apoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 1,又称BLyS 或BAFF ) 同源序列比对基础上进行突变位点设计,借助一步反向PCR 致突变法构建人sAPRIL cDNA 的两个突变体,进而对sAPRIL 及其突变体蛋白进行表达、纯化及生物学活性检测。取得的主要结果如下: 1. 经RT-PCR 成功地克隆了编码人APRIL 胞外区105-250 的cDNA(即sAPRIL cDNA),经查对,与GenBank 上登录的编码相应APRIL 胞外区cDNA 的序列完全一致。 2. 以获得的pUC19/sAPRIL 为模板,经一步反向PCR 法成功构建了缺失编码第187 位谷氨酰胺的CAA 和以编码甘氨酸的GGA 替换CAA 的两个突变体cDNA,分别命名为pUC19/msAPRIL1 和pUC19/msAPRIL2。 3. 将上述测序正确的野生型和突变型目的片段分别连接于原核表达质粒pQE-80L,成功地构建了重组原核表达质粒pQE-80L/sAPRIL、pQE-80L/msAPRIL1 和pQE-80L/msAPRIL2。 4. 将上述质粒分别转化大肠杆菌DH5α,经IPTG 诱导,均获得了较高水平的表达,并确立sAPRIL 及其突变体msAPRIL 1、msAPRIL 2 在大肠杆菌中高效表达的最佳诱导表达条件均为终浓度1mmol/L 的IPTG 在37℃诱导表达4h。SDS-PAGE 分析可见,各重组蛋白的大小均约为19kDa,主要是以包涵体的形式存在。Western blotting分析显示,各目的蛋白均在分子量约19kDa 处出现单一条带。 5. 经Ni~(2+)-NTA 纯化系统及尿素透析,各重组蛋白得到了有效纯化和复性。纯化蛋白在SDS-PAGE 上呈现单一条带。 6. 生物学活性分析显示,所制备的重组人sAPRIL 有明显促进人A549 肺癌细胞
【图文】：

质粒 pUC19/ sAPRIL 由第一部分实验获得；一步反向 PCMutanBest Kit)购自大连 TaKaRa 公司，其余原核表达载体构建化及复性等所需试剂和仪器同第一部分。方 法 sAPRIL 不同突变体 cDNA 的获得引物的设计与合成 针对 sAPRIL 第 187 位氨基酸设计突变氨酰胺（msAPRIL1）；②以一个甘氨酸替换第 187 位谷氨酰胺（，在待突变部位的两侧沿相反方向设计一对引物，针对 msA使上游或下游引物 5' 端的起点向相应引物的 3'端移动待缺失单纯置换突变），则将拟用作置换的序列直接设计在上游或下2) 。

染色可见细胞核，证实该阴性对照的可信性(参见照片 20、21、22、23)。在免疫荧光显微镜下观察可见：A549 细胞呈现多形性，核仁多个且不规则；用sAPRIL、msAPRIL1 和 msAPRIL2 孵育的 A549 细胞胞膜、胞浆呈现较强荧光；用sAPRIL 蛋白孵育的 A549 细胞还在核膜和核内显示出特异的高强度荧光。用 PBS 及相同蛋白浓度 DHFR 孵育的细胞则仅可观察到少许非特异性荧光杂质(参见照片 24、25、26、27、28)。2. 各重组蛋白与 Jurkat 淋巴瘤细胞的结合情况流式细胞仪检测发现，用 sAPRIL、msAPRIL1 和 msAPRIL2 作用于 Jurkat 细胞后检测其平均荧光强度分别为 91.55、71.52 和 109.44，而对照组中用同样方法纯化的 DHFR处理的 Jurkat 细胞荧光强度仅为 39.41，与用 PBS 处理的 Jurkat 细胞相当(各组平均荧光强度为 31.90、34.05、34.25、36.97)。经换算成荧光系数后， msAPRIL1 的荧光系数为1.09，，说明其与 Jurkat 细胞具有中等结合力；sAPRIL 的荧光系数为 1.69，说明其与 Jurkat细胞结合力高，而 msAPRIL2 的荧光系数为 1.96，说明其与 Jurkat 细胞结合力最高(图 7、8、9、10，表 1)。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R346

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本文编号：2532033