血管内皮细胞生长因子受体-2单克隆抗体的制备及相关生物学活性研究

发布时间：2019-09-10 21:51

【摘要】：目的：1．克隆血管内皮细胞生长因子受体-2(VEGFR-2／KDR)胞外段三区基因。2．制备具有良好抗原性的人KDR3重组蛋白。3．制备具有生物学活性的VEGF_(165)重组蛋白。4．制备抗人KDR3单克隆抗体，研究所获得抗体的相关生物学活性。为进一步研究血管内皮细胞生长因子受体-2抗体在肿瘤诊断和治疗中的作用奠定基础。方法：1．从ECV304细胞株中提取总RNA，逆转录获得cDNA，用设计合成的人VEGFR-2／KDR胞外段三区基因的引物，以PCR的方法扩增人VEGFR-2／KDR胞外三区基因，连接到T载体测序。2．将人VEGFR-2／KDR胞外三区基因克隆至原核表达载体pET28a(+)中，将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α内并提取质粒，双酶切鉴定，将鉴定的阳性表达载体质粒pET28a(+)-KDR3转化至大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，表达产物用Ni~(2+)-NTA纯化，收集洗脱液。3．同KDR3制备方法制备VEGF_(165)。将制备的VEGF165按一定的浓度梯度入加到接种有HUVEC细胞的96孔细胞培养板中，培养24h，加入MTT，酶标仪测定细胞培养物A_(570nm)值。4．用重组人KDR3蛋白免疫BALB／c小鼠，取脾B淋巴细胞与SP2／0细胞融合，有限稀释法筛选、制备单克隆细胞株。将单克隆细胞株接种到降植烷致敏的F1代小鼠腹腔，2周后收集腹水，腹水用Protein ASepharose CL-4B柱纯化。Western Blot鉴定其抗原的结合特性，，在VEGF_(165)刺激HUVEC细胞增殖实验中加入纯化的抗人KDR3单抗，培养24h，加入MTT，酶标仪测定细胞培养物A_(570nm)值。结果：1．扩增获得的人VEGFR-2／KDR胞外三区基因测序结果与genebank中的KDR序列一致。2．构建的pET28a(+)-KDR3重组质粒双酶切后，琼脂糖凝胶电泳见300 bp左右大小的DNA条带。pET28a(+)-KDR3／BL21(DE3)诱导后有相对分子质量为16 000的蛋白表达。3．构建的pET28a(+)-VEGF_(165)重组质粒双酶切后，琼脂糖凝胶电泳见约580 bp大小的DNA条带。pET28a(+)-VEGF_(165)／BL21(DE3)诱导后有相对分子质量为26 000的蛋白表达。在0.02μg／ml到0.5μg／ml浓度范围内随着VEGF_(165)浓度的增高，MTT吸光度值相应增高。4．纯化获得了4株抗人VEGFR-2／KDR胞外段三区的单克隆抗体。Western Blot结果显示单克隆抗体2C2能与人KDR3特异性结合。加有单克隆抗体2C2组的MTT吸光度值与未加2C2组比较有显著性差异。结论：1．成功地克隆了人VEGFR-2／KDR胞外三区基因。2．获得了具有良好抗原性的人VEGFR-2／KDR胞外段三区重组蛋白。3．获得了VEGF_(165)重组蛋白，该蛋白具有刺激血管内皮细胞增殖的生物学活性。4．获得4株能分泌抗人KDR3单抗的杂交瘤细胞株。2C2单抗能抑制VEGF_(165)刺激血管内皮细胞的增殖。为进一步研究抗人KDR3抗体在抗血管新生及肿瘤诊断、治疗中的作用奠定基础。
【图文】：

电泳图,扩增片断,电泳图

KDR3扩增片断电泳图

基因测序,二心

2.人KOR3的克隆与测序测序结果与genebank中人KDR基因序列比对，得到一个与genebank中的人KDR基因序列一致的阳性克隆 pMD18一T一KDR3(见图3.2)。由于引物设计时已引入酶切位点，所以KDR三区基因片段两端分别带有BamHI和Xhol酶切位点。4〕 5060703090上0〔全，忿白幻咒.勺弓粼节生，二今r节叮兮己扁亡个勺二心r了予二盖T心忿叙孟TTI雪盏点巴叮孟爪:丁己了予弓已扁心孟孟孟扁.二二几万p号节士，T孟公JUUJIUJ之UJ‘JL‘J‘UJ’JU二C启〕介二‘二八GT心(夕二C了G人了二了蛇r二忿尸公二六‘，二入或.二尸公二:人C占飞一l一I，二矛二‘.二.二心甲二二_飞夕二几亩公;二沈月二了C〔;八90京图3.2人KDR3基因测序结果图
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】