重组sCD83和sBTLA对DC活性及sCD83对同种皮肤移植物存活的影响

发布时间：2019-09-11 20:48

【摘要】： 一、前言 移植排斥反应是导致临床同种移植术失败的主要原因。一般认为，T细胞应答及其效应是介导移植排斥反应发生的主要机制。双信号假说认为T细胞活化需两个信号：信号1由TCR识别APC表面的抗原肽-MHC复合物(p-MHC)所启动；信号2由T细胞和APC间共刺激分子的相互作用所启动。两个信号的整合可最有效地诱导T细胞活化，而缺乏共刺激信号可致T细胞应答下降，某些情况下可诱导耐受或T细胞失能(anergy)。 近年来，对共信号分子(co-signalling molecule)的研究不断深入，并对双信号学说形成挑战。Chen Lieping提出T细胞活化的共信号网络学说，其要点是：虽然TCR信号是T细胞活化所必需，但并不能决定T细胞活化的方向，而共信号(共刺激信号和/或共抑制信号)才是引导抗原特异性T细胞应答的关键。根据该理论，阻断T细胞活化的共刺激信号或增强共抑制信号，均可负调节T细胞活性，从而诱导T细胞产生免疫耐受。 抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)介导的抗原提呈是T细胞识别同种抗原的关键环节。目前认为，树突状细胞(dendritic cell，DC)成熟状态在T细胞识别同种抗原中起重要作用，并直接影响免疫应答的强度和类型：成熟DC表面表达多种共刺激分子(如CD80、CD86、CD40等)、黏附分子(如CD54、CD58等)和MHCⅠ和Ⅱ类分子，，其功能主要是诱导免疫应答；未成熟DC低表达共刺激分子、黏附分子和MHC分子，其诱导T细胞激活的能力很弱，可能在免疫耐受形成中发挥重要作用。 CD83属免疫球蛋白超家族，与B7家族成员具有一定同源性，是成熟DC的表面标志，其生物学功能尚未完全清楚。已发现，伴随DC成熟，其表面CD83与其他共刺激分子(CD80、CD86)的表达亦升高，提示CD83具有重要生物学功能。文献报道，CD83在T细胞成熟和活化中起重要作用，其实验依据为：①可溶性CD83可抑制T细胞活化，提示CD83可能是参与T细胞活化的共刺激分子之一；②可溶性CD83可抑制DC表达共刺激分子，并下调DC的共刺激活性，从而抑制DC对T细胞的活化。 BTLA(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)是最近发现的CD28家族成员，与该家族另两个抑制性受体(CTLA4、PD1)有相似分子结构。研究发现，BTLA参与维持自身耐受，并是下调Th1细胞活性的重要因子，相关实验依据为：①BTLA主要表达于活化的T和B细胞表面，尤其持续高表达于Th1细胞表面；②BTLA缺陷动物易诱发EAE。最近发现，“疱疹病毒进入介质”(herpesvirus entry mediator，HVEM)是BTLA的配体，BTLA结合HVEM的部位与LIGHT不同，但与疱疹病毒糖蛋白D(Herpesvirus glycoprotein D，gD)的结合部位相重叠。已证实，HVEM与T细胞表面BTLA结合，可启动正向信号而抑制T细胞活化，其机制尚不清楚。有关HVEM-BTLA途径介导反向信号对HVEM表达细胞的影响，迄今尚未见报道。 鉴于可溶性CD83具有抑制T细胞增殖和抑制DC共刺激活性的双重作用，本课题探讨可溶性CD83延长同种皮肤移植物存活的作用，并初步探讨其机制，以期为将CD83应用于临床治疗移植排斥反应提供理论和实验依据。 另外，本研究克隆小鼠BTLA基因，探讨HVEM-BTLA反向信号对DC表达共刺激分子的影响，为将BTLA作为抗移植排斥反应的分子靶点提供理论和实验依据。 二、小鼠CD83、BTLA和人IgG1αFc基因克隆和真核表达载体构建 采用TRIzol试剂提取小鼠脾脏和人外周血单个核细胞总RNA，经RT-PCR扩增小鼠CD83和BTLA基因以及人IgGlαFc(hIg)基因，并克隆至pcDNA3.1(+)载体中。构建pmCD83-hIg和pmBTLA-hIg表达载体，经酶切和DNA序列测定鉴定，结果表明：成功克隆了小鼠CD83、BTLA胞外功能区基因和hIg基因，成功构建了表达小鼠CD83或BTLA胞外功能区与人IgGlαFc融合蛋白(mCD83-hIg或mBTLA-hIg)的真核表达载体。 三、可溶性mCD83-hIg的制备及生物学功能的研究 采用Lipofectamine ~(TM)2000将pmCD83-hIg载体转染COS-7细胞，在COS-7细胞中表达可溶性mCD83-hIg融合蛋白；采用Western blot、ELISA检测COS-7细胞培养上清中所表达的mCD83-hIg融合蛋白，并用人IgG作为标准品对mCD83-hIg进行定量检测；采用RT-PCR检测mCD83-hIg融合基因mRNA表达。结果表明：转染pmCD83-hIg的COS-7细胞培养上清液可与抗小鼠CD83抗体形成明显条带，其分子量约39.8kD，与预期结果相一致；转染后前4天细胞培养上清中融合蛋白表达量增高较快，但5～7天仅有轻度增高，最高达380μg/L；转染pmCD83-hIg的COS-7细胞可表达mCD83-hIg融合基因mRNA，在约120bp处呈现一明显条带，与预期结果一致。 采集转染pmCD83-hIg的COS-7细胞培养上清液，借助Protein A shepharose CL-4B亲和层析柱纯化mCD83-hIg融合蛋白；经浓缩透析，借助SDS-PAGE鉴定融合蛋白纯度，纯化的融合蛋白在约39.8kD处形成一条带，提示纯化蛋白纯度较高，可用于后续实验研究。 借助倒置显微镜观察小鼠DC细胞系(DC2.4)形态；FCM鉴定其表面标志。结果显示：DC2.4呈典型树突状细胞形态，表面高表达CD83、CD80和CD86，表明DC2.4为成熟的小鼠DC，可作为DC研究的细胞模型。 将mCD83-hIg加入到DC2.4培养体系中，72小时后应用PI染色，FCM检测DC细胞周期和细胞凋亡，并检测DC表面共刺激分子表达、IL-12产生及其刺激同种T细胞活化的能力。结果显示：mCD83-hIg对DC2.4细胞周期和细胞凋亡无影响，但可下调CD83、CD80和CD86表达，显著抑制LPS刺激的IL-12产生，并显著抑制DC2.4的共刺激活性。 分离BALB/c小鼠脾脏T细胞作为反应细胞，C57BL/6小鼠脾细胞作为刺激细胞，进行单向MLR，以检测mCD83-hIg对同种T细胞增殖的影响。结果发现：mCD83-hIg可显著抑制T细胞增殖，抑制IL-2和IFN-γ产生，并呈剂量依赖性，但对IL-4和IL-10产生无影响。 以上结果说明：可溶性mCD83-hIg可抑制DC表面共刺激分子表达，抑制LPS诱导的IL-12产生，从而抑制DC的共刺激活性；可溶性mCD83-hIg也可抑制T细胞增殖和产生IL-2、IFN-γ。因此，可溶性CD83可分别作用于DC和T细胞，从而对T细胞应答发挥双重调节作用。 四、mCD83-hIg延长同种皮肤移植物存活时间的实验研究 建立小鼠同种皮肤移植模型。在皮肤移植前1天、移植后第1天和第3天，分别用可溶性mCD83-hIg处理皮肤移植受者，观察皮肤移植物存活时间，并以人IgG和PBS作为对照。结果发现：mCD83-hIg处理组移植物平均存活时间为(12.57±2.07)天，人IgG对照组为(8.57±1.51)天，PBS对照组为(8.71±1.11)天，mCD83-hIg处理组皮肤移植物存活时间显著长于对照组(P＜0.01)。 移植后第7天，取移植皮片进行组织学分析，并借助RT-PCR检测某些细胞因子mRNA表达；取受者外周血检测血清某些细胞因子水平；取供者脾细胞再次刺激受者脾脏T细胞，检测后者对供者同种抗原的再次应答能力。结果发现：①mCD83-hIg处理组皮肤移植物中炎性浸润明显低于对照组，对照组皮肤移植物中有较多炎性细胞浸润，主要为单个核细胞，且毛细血管严重充血，出血，组织出现小溃疡灶；②mCD83-hIg处理组皮肤移植物中炎性细胞因子IL-2和IFN-γmRNA表达显著低于对照组(P＜0.01或P＜0.05)，但各组间IL-4和IL-10mRNA表达无差异；③mCD83-hIg处理组受者血清IL-2和IFN-γ水平也显著低于对照组(P＜0.01)，各组间血清IL-4和IL-10水平亦无有差异；④mCD83-hIg处理组受者脾脏T细胞对供者脾细胞再刺激的增殖活性显著低于对照组。 以上研究结果表明：可溶性CD83在体内可抑制同种T细胞活化，抑制Th1型细胞分化和细胞因子产生，从而延长同种皮肤移植物存活。提示：可溶性CD83在治疗移植排斥反应中可能具有较好应用前景。 五、重组GST-mBTLA融合蛋白的表达及抗血清的制备 构建谷胱甘肽-S-转移酶—小鼠BTLA胞外功能区融合基因(GST-mBTLA)的重组质粒：在E．coli BL21(DE3)中表达重组GST-mBTLA融合蛋白；借助Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白，经SDS-PAGE鉴定，纯化的重组蛋白达到电泳纯；将重组蛋白免疫家兔，制备兔抗GST-mBTLA血清，其双扩散效价为1：16，ELISA效价为1：3200。 六、可溶性mBTLA对DC表面共刺激分子表达的影响 将pmBTLA-hIg载体转染DC2.4细胞，筛选稳定表达细胞株。采用Western blot、ELISA检测细胞培养上清中mBTLA-hIg融合蛋白含量，并用人IgG作为标准品定量检测mBTLA-hIg；借助RT-PCR检测mBTLA-hIg融合基因mRNA表达。结果表明：稳定转染pmCD83-hIg的DC2.4细胞培养上清液可与抗mBTLA抗体形成明显条带，其分子量约43.3kD，与预期结果相一致：1×10~4pmBTLA-hIg稳定转染的DC2.4，(在2.5ml培养基中)所分泌mBTLA-hIg融合蛋白水平呈时间依赖性，最高达230ug/L；借助RT-PCR，证明转染pmBTLA-hIg的DC2.4可表达mBTLA-hIg融合基因mRNA，在约175bp处呈现一明显条带，与预期结果一致。 将稳定表达mBTLA-hIg的DC2.4培养72小时，经PBS洗涤，用FITC标记的抗人IgG1单抗染色，借助FCM检测细胞表面是否结合mBTLA-hIg。结果表明：稳定表达mBTLA-hIg的DC2.4能与FITC标记的抗人IgG1抗体结合，说明mBTLA-hIg可结合到DC2.4表面；借助FCM分析稳定表达mBTLA-hIg的DC2.4表面共刺激分子表达，发现CD80表达高于未转染细胞，而CD86表达低于未转染细胞；将GST-mBTLA融合蛋白加入未转染DC2.4培养体系中，借助FCM检测共刺激分子表达，发现GST-mBTLA融合蛋白可上调DC2.4表面CD80表达，并呈剂量依赖性，但GST-mBTLA对DC2.4表面CD86表达无影响。进一步在DC培养体系中加入兔抗小鼠GST-mBTLA血清，检测抗血清的阻断效应，结果发现：可溶性mBTLA对DC表面共刺激分子表达的影响可被兔抗小鼠GST-mBTLA血清所阻断。 上述结果说明：可溶性mBTLA可调节DC表面共刺激分子表达，即可调节DC的共刺激活性，该效应可能是HVEM-BTLA反向信号作用于DC的结果。进一步研究BTLA对DC生物学行为的影响及其分子机制，不仅具有重要理论意义，也可望为探寻干预免疫相关疾病的策略提供理论和实验依据。 七结论 1．可溶性CD83的生物学效应为：①下调DC表面共刺激分子表达和IL-12产生，从而抑制DC的共刺激活性；②通过抑制T细胞增殖、Th1型细胞分化和细胞因子产生，从而在DC和T细胞两个调节点对免疫应答起负性调节作用。 2．给予可溶性mCD83-hIg可延长小鼠同种皮肤移植物存活时间，提示其可能是一种有效的免疫抑制剂，并可望在治疗移植排斥反应和自身免疫病中具有应用前景。 3．可溶性mBTLA可调节DC表面共刺激分子表达，该效应可能是HVEM-BTLA途径反向信号作用的结果。
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华中科技大学同济医学院博士学位论文见图1一5一8，mcD83ext插入PcDNA3.1一hlg后采用T7和sP6通用引物测序，证明mCD83的序列与Genebank中所公布序列完全一致 (NM009856)。ABbpbpp皿b加1000750500 111069715000100007弓00500025001000413250图1一 4mCD83基因克隆和pmCn83一hlg载体构建Figl一 3AmPlificationofmurineCD83genebyRT一 PCRandconstruetionofPmCD83一 hlgreeombinantveetor A:eDNAofmurineCD83amPlifiedfrommousesPleenbyRT-PCR.PCRProduetionofmurine CD83wasan806bPfragement.B:IdeniificationofPmCD83一 hlgreeombinantveetorbythe restrictionendonucleasedigestion.l:PmCD83一 hlgdigestedbyHindlllonly;2:PmCD83一hlg digestedbyHindlll/B翩Hl， releasea413bPfragementofCD83ext:3:PmCD83一hlgdigestedbyBamHI/Xbal， releasea697bPfragmentofhlgFe;4:PmCD83一 hlgdigestedbyHindlll/乃al， releasea1110bPfragmentofmB7h3一 hlg;M:DNAmarker.

2.采用PCR技术自pGEMT-mBTLA质粒中扩增 mcD83extDNA，并克隆至PcDNA3.1一Mg载体的hlg上游，分别经Hin班Il/B“mHI、B“mHI/乃clI和Hindlll/乃aI双酶切鉴定，结果酶切片断大小和预期结果一致(图1一9一B)。序列测定结果显示，克隆的mBTLA序列与Geneballk中所登录的小鼠BTLA序列(AY293285)完全一致(图1一10)。ABBTLA五任 1234MbP9171000500图1一 9mBTLA基因克隆和载体构建鉴定Figl一 9AmPlifieationofxnouseBTLAgenebyRT一 PCRandconstructionofPmBTLA一 hlgrecombinantvector A:cDNAofmouseBTLAamplifiedfrommousesPlenieeellsbyRl’ -PCR， BTLA:PCRProduction ofmouseBTLA;M:DL20OODNAmarker.B:IdentifieationofPmBTLA一 hlgrecombinantveetor bytherestrietionendonueleasedigestion.1:PmBTLA一 hlgdigestedby关刀力 dlllonly;2:PmBTLA一 hlgdigestedbyHin班11/乃al， releasingafragmentof1228bPcontainingBTLAand hlgFe:3:PmBTLA一 hlgdigestedbyBamHI/乃al， releasingafragmentof697bPofhlgFc:4:PmBTLA一 hlgdigestedbyHindlll/BamHIreleasingafragmentof531bPofB丁’LA;M:DNA markerIV‘
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R622;R392

【引证文献】

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1 李坤;人可溶性CD83基因的克隆、原核表达、纯化及其融合蛋白活性检测[D];第四军医大学;2008年

本文编号：2534654