表皮体外重建模型的建立及性状研究

发布时间：2019-09-12 00:54

【摘要】： 目的为了满足皮肤科学基础和临床发展的需要，近年来人们进行体外重建皮肤的各种尝试。在实验室重建的皮肤，是由种子细胞或皮瓣在真皮替代物上进行诱导、发育、分化成类似在体皮肤的完整表皮，称为人工皮肤或皮肤替代物。这种人工皮肤一般应具有表皮和真皮双层结构并具备皮肤的生物学特征。随着种子细胞培养技术和真皮替代物的发展，人工皮肤不仅用于创伤(如烧伤)后皮肤的移植和修复，还可用于皮肤发育、皮肤病发病机理等的研究，有着广阔的应用前景。多年来人们期望在体外建立一种能够模拟在体皮肤损伤修复过程的模型，即损伤边缘角质形成细胞分裂增殖，向创面移行，最后覆盖创面，新生表皮完成修复和重塑的过程。这一过程涉及到与表皮发育相关的细胞增殖、迁移和分化三个重要步骤。对这一过程的研究可以帮助了解和深入研究与皮肤发育和修复相关的诸多问题，从而具有潜在的基础理论价值和实际应用前景。为此，本研究应用器官型培养技术，利用去表皮的真皮组织(de-epidermized dermis，DED)作为真皮替代物，拟建立一种以观察表皮发育并以荧光素跟踪测量表皮生长的皮肤体外重建模型，用于研究表皮的修复以及生物、药物等因素对表皮发育的影响。材料和方法一、真皮替代物制备及器官培养 1、去表皮的真皮组织(DED)制备：健康成人皮肤标本用PBS清洗数次，将标本表皮向下，真皮向上平展于超净工作台的平台上，在解剖显微镜下用眼科弯剪仔细去除皮下组织，至到约2.5mm厚，用10mm的活检器取材，将取下的标本浸于PBS中，然后置于56℃的水浴箱中30min，取出后将表皮与真皮分离，去除表皮。将真皮部分(DED)置于平皿中室温下约1h将其凉干，后放置于聚乙烯塑料瓶中，加一滴DMSO，封闭瓶盖，迅速置入液氮(-120～-160)中约5～7min，取出后于室温放置30min，然后再置入液氮中。这样连续反复10个循环，将DED中细胞成分杀死。后将其放入-76℃冰箱中备用。 2、支撑架的制备：为使表皮组织能在空气-液面培养，将70μm目筛的细胞过滤器修剪成培养支撑架，放入6孔培养皿的培养孔中。培养液能够通畅地穿过孔筛，保障表皮组织在接触空气的液面生长。 3、微小皮瓣的制备：取健康人正常皮肤，用PBS清洗数次，置于超净工作台，自然平展标本，用2mm活检器取样，在解剖显微镜下用剪刀小心去除皮下组织及深层真皮，保留浅层真皮组织，然后将标本的真皮面轻沾混合组织胶，表皮部分朝上，真皮部分朝下，置于DED上。然后将DED移至六孔培养皿的支撑架上，每孔加约5ml基础培养液，空气—液面培养，2-3天换液一次。 4、培养液配制：基础培养液为DMEM与F-12营养液3∶1混合，胰岛素(5μg／ml)，腺嘌磷(0.18mM)，氢化考的松(0.5μg／ml)，霍乱弧菌毒素(10~(-10)M)，链霉素(100μg／ml)，青霉素(100 units／ml)，1％非必需氨基酸，10％胎牛血清。根据实验需要添加其它成分。二、组织结构及分化标记物检测 1、组织结构检测：用光镜、透射及扫描电镜观察DED及新生表皮组织结构及超微结构。与此相关的组织染色包括苏木素-伊红染色，过碘酸雪夫氏染色，苦味酸-酸性品红染色，间苯二酚-碱性品红染色，苦味酸-酸性品红与间苯二酚-碱性品红双染色等。 2、免疫组化检测：与细胞增殖相关的检测包括：Ki67抗原，5-溴脱氧尿嘧啶核苷，Hoechst33258；与细胞分化相关的检测包括：角蛋白-1，角蛋白-14，包膜蛋白，beta-1整合素，谷氨酰胺转移酶-1；与组织或细胞鉴定相关的检测包括：Vimentin，Ⅳ型胶原，CD1a，Me1-5，板层素等。三、萤光成像测量新生表皮生长 1、萤光素配制：二乙酸萤光素(fluorescein diacetate，FDA)和5-氯甲基二乙酸萤光素(5-chloromethylfluorescein diacetate，CMFDA)作为萤光素用于本实验，发光波峰分别为：490／515nm和492／516nm。FDA及CMFDA的储藏浓度为24mM，于-20℃避光，冰柜保存。工作浓度为2.4μM。 2、表皮生长及萤光成像测量：将新配制的FDA或CMFDA约150μl轻轻加至培养物表面，然后移到萤光显微镜下观察，以新生表皮呈兰色萤光判断表皮生长，并用数码相机摄像。在萤光显微镜下摄像后弃去萤光素，培养皿中加适量培养液继续培养。后用图像分析软件计算新生表皮生长萤光面积(πr~2)，计算时除去皮瓣面积，即实际新生表皮生长面积mm~2=新生表皮生长萤光面积—皮瓣面积。 3、新生表皮增殖活性的测量：用Leica’s Q500成像分析软件测量新生表皮厚度，有核细胞层数，表皮突指数(基底膜长度／表皮生长长度)及新生表皮增殖细胞密度(基底细胞及邻近的棘细胞Ki67阳性或BrdU阳性细胞数／每毫米基底膜长度(mm)=新生表皮增殖细胞密度)。四、统计学分析数据分析选用GraphPad Prism 4.00 for Windows软件包和SPSS 11 for Windows软件包。数据均值与标准差以(?)±SD表示。P值≤0.05表示有统计学差异。结果一、重建表皮及真皮替代物特征 1、去表皮的真皮组织(DED)的生物学特性：PAS染色可见DED表面存在一条均匀一致的紫红色带、显示PAS反应阳性，说明DED的表层含有较多量的中性粘多糖。用免疫组化方法显示在4DED表面PAS反应阳性相同部位有Ⅳ胶原的均匀着色，说明DED的表面存在基底膜的蛋白成分。用透射电镜观察到重建表皮与真皮之间部分基底膜结构及表皮侧的半桥粒结构。免疫组化Vimentin染色显示DED无成纤维细胞。经苦味酸-酸性品红染色，间苯二酚-碱性品红染色，苦味酸-酸性品红与间苯二酚-碱性品红双染色等显示DED组织中富含胶元纤维及弹力纤维。扫描电镜观察到DED中交错排列的致密胶元纤维。 2、重建表皮结构特征：培养10天后，光镜下可见DED上有完整的表皮结构。表皮与人工真皮犬牙交错，表皮突呈高低不平的乳头状伸入真皮。在缺失基底膜的DED侧面生长的新生表皮，结构完整性严重缺陷，与相同时间在DED表面生长的新生表皮比较，尽管也有角质层的形成，但表皮细胞间出现裂隙。扫描电镜显示基底层与真皮连接处的纤维丝状结构。透射电镜可观察到棘细胞浆中成束排列的张力细丝，细胞浆中有类似黑素小体的结构，但角蛋白小体不明显。相邻棘细胞间可见突起的桥粒结构。在正常皮肤中，可观察到免疫组化CD1a染色呈阳性的细胞分布于表皮的基底层，，棘层及真皮浅层。培养3天后，微小皮瓣表皮中仍见少量CD1a阳性细胞。重建的新生表皮中无CD1a阳性细胞。同样，重建的新生表皮中Me1-5染色阴性。说明重建表皮无朗格汉斯细胞，也无黑素细胞。气-液面培养20天后，角质层明显增厚，仍可见基底层有核细胞分裂增殖。 3、重建表皮表达分化蛋白标记： (1)重建表皮表达角蛋白-1：角蛋白-1是表皮组织分化的早期蛋白标志。本实验显示在培养第10天的新生表皮中角蛋白-1主要表达于基底层以上的表皮内。与正常皮肤中的表达部位基本一致。 (2)重建表皮表达角蛋白-14：本实验显示在培养第10天的表皮中，角蛋白-14主要表达在新生表皮的基底层，部分靠近基底层的棘层角质形成细胞中。培养20天后，大量角质层组织形成，而角蛋白-14仍然清晰地呈现于基底层及部分棘层内。与正常皮肤中的表达部位基本一致。 (3)重建表皮表达包膜蛋白：本实验显示培养第5天后，包膜蛋白表达于新生表皮基底层以上的表皮中，包括棘层，颗粒层及角质层。培养第6天，包膜蛋白在上述部位的表达更加清晰。培养第9天，包膜蛋白清晰地分布于颗粒层及角质层，棘层KC不表达。培养第12天，包膜蛋白呈带状分布于临近颗粒层的棘层上部及颗粒层。 (4)重建表皮表达谷氨酰胺转移酶-1：本实验显示培养第10天后，谷氨酰胺转移酶-1主要表达于棘层及颗粒层，基底层也有弱表达。 (5)重建表皮表达β-整合素：本实验显示培养第10天后，β-整合素主要表达于新生表皮的基底层及棘层中。 4、重建表皮表达细胞增殖标记物： (1)表皮增殖细胞表达Ki67抗原：正常表皮的基底层可见Ki67阳性细胞，表皮增殖细胞密度为5.47±1.27；培养1天后，新生表皮基底层有较多的Ki67阳性细胞，新生表皮增殖细胞密度为42.32±4.54；培养3天后，新生表皮基底层细胞增殖活跃，新生表皮增殖细胞密度为50.86±3.67；培养10天后，新生表皮结构逐渐完整，基底层及临近的棘层中角质形成细胞分裂仍然活跃，新生表皮增殖细胞密度为33.79±3.27；培养20天后，新生表皮形成较厚的角质层，基底层仍见较多K67阳性细胞，新生表皮增殖细胞密度为21.668±4.40。 (2)表皮增殖细胞被5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记：Brdu阳性细胞清晰地表达于新生表皮的基底层，少数Brdu阳性细胞也可见于近基底层的棘层角质形成细胞中。二、荧光定量检测新生表皮生长面积 1、表皮生长的荧光及组织学检测：微小皮瓣接种于DED上1天后，即有角质形成细胞开始在皮瓣的边缘向外生长并与DED面接触(见图3)。2-3天后在皮瓣与DED面之间形成多层的表皮样结构，然后新生表皮向下包绕皮瓣，同时沿着DED面向外生长，这时可以在萤光显微镜下观察到完整或欠缺的萤光环(见图4)。5-7天后新生表皮继续沿DED面生长，表皮突形成，从基底层到角质层表皮发育显现完整并日渐成熟，而皮瓣下的新生表皮也完成了衔接，尽管无角质层的呈现，但可见发育较好的有核细胞的表皮，可见多个表皮突伸向真皮。这时在萤光显微镜下可以观察到萤光环更加明显，半径增大。10-12天新生表皮几乎覆盖整个DED表面，然后原皮瓣开始从新生表皮分离脱落，同时萤光显微镜可观察到DED表面的圆形光面。 2、荧光测量表皮生长的重复性及有效性测试： (1)批内变异：用CMFDA及FDA进行批内变异测试。CMFDA组：标本取自整形外科，健康人腹部皮肤(61岁妇女)。取36块微小皮瓣分别培养于DED上，于培养的第2天，5天，7天，9天换液时，用CMFDA荧光素在荧光显微镜下标记新生表皮生长并摄像，然后测量计算表皮生长面积，批内变异分别是41.2％(2天)，18.8％(5天)，12.87％(7天)，9.47％(9天)。FDA组：另取一34岁健康妇女乳房区皮肤，将24块微小皮瓣于DED上培养，在培养的第3天，5天，7天，10天换液时，用FDA荧光素在荧光显微镜下标记新生表皮生长并摄像，然后测量计算表皮生长面积，批内变异分别是34.1％(3天)，22.3％(5天)，13.79％(7天)，10.99％(10天)。 (2)批间变异：标本分别来自不同个体和不同部位。分别为A，B，C，D四组。组A：标本为34岁女性乳房区皮肤；组B：标本为51岁男性腹部皮肤；组C：标本为50岁女性腹部皮肤；组D：38岁女性乳房区皮肤。分别于培养的第3天，5天，7天，10天换液时，用FDA荧光素在荧光显微镜下观察新生表皮生长，然后在培养的第3天，第5天，第7天，第10天，分别计算四组新生表皮生长面积，经统计学分析(One-way Anova)，四组间新生表皮生长面积均值有显著差异(P＜0.01，3天；P＜0.01，5天；P＜0.01，7天；P＜0.01，10天)。 (3)荧光素FDA及CMFDA对表皮生长的影响：为了解荧光素FDA及CMFDA对表皮生长的影响，我们用36个微小皮瓣随机分为三组：FDA组，CMFDA组和DMSO对照组。每组12个微小皮瓣进行器官培养，连续培养共10天。FDA组和CMFDA组：于培养的第3天，第5天，第7天及第10天分别加FDA或CMFDA摄像并计算表皮生长面积；DMSO组：于培养的第3天，第5天，第7天加同剂量的DMSO并于第10天加FDA摄像并计算新生表皮生长面积。经统计学分析，在第3天、5天、7天、10天，FDA组和CMFDA组新生表皮生长面积均值比较无显著性差异(P＞0.05，P＞0.05，P＞0.05，P＞0.05)。在培养第10天FDA、CMFDA和DMSO三组间新生表皮生长面积均值比较也无统计学差异(P＞0.05，One-way Anova)。三、表皮生长因子及糖皮质激素对表皮生长的影响 1、表皮生长因子对表皮生长的影响：用24个微小皮瓣随机分为二组：EGF组(含10ng／ml EGF)和无EGF对照组(基础培养液)。培养3天后EGF组新生表皮生长面积为(3.77±1.31)，比较对照组(2.077±0.152)有统计学差异，t=4.58，p＜0.01；5天后EGF组新生表皮生长面积为(19.52±1.08)，比较对照组(11.18±0.63)有统计学差异，t=6.52，p＜0.01；7天后EGF组新生表皮生长面积为(26.25±2.37，)，比较对照组(13.33±2.40)有统计学差异，t=14.89，p＜0.01；10天后EGF组新生表皮生长面积为(28.04±0.64)，比较对照组(17.72±1.05)有统计学差异t=8.34，p＜0.01。EGF组新生表皮生长厚度(91.2±11.2)明显高于对照组(60.9±7.22)，p＜0.01；新生表皮有核细胞的细胞层数(10.4±0.73)明显多于对照组(8.1±0.58)，p＜0.05；新生表皮突增殖指数(1.49±0.03)明显多于对照组(1.25±0.03)，p＜0.05；新生表皮增殖细胞密度(41.8±2.42)明显高于对照组(35.3±3.06)，p＜0.05。 2、倍他米松戊酸酯对表皮生长的影响：用24个微小皮瓣随机分为二组：倍他米松戊酸酯组(含10~(-3)M倍他米松戊酸酯)和对照组(基础培养液)。培养第9天，倍他米松戊酸酯组新生表皮生长面积为(16.43±4.14)，对照组为(21.09±3.740)，经统计分析有显著性差异p＜0.05。倍他米松戊酸酯组新生表皮厚度为(43.69±9.29)，对照组为(57.85±12.42)，经统计分析有显著性差异p＜0.05。倍他米松戊酸酯组新生表皮细胞层数(5.92±1.03)，对照组为(7.17±1.28)，经统计分析有显著性差异p＜0.05。倍他米松戊酸酯组新生表皮突增殖指数为(1.031±0.15)，对照组为(1.3±0.33)，经统计分析有显著性差异p＜0.05。倍他米松戊酸酯组新生表皮增殖细胞密度为(29.57±6.08)，对照组为(36.05±3.17)，经统计分析有显著性差异p＜0.01。结论 1、去表皮的真皮组织为富含胶原的三维结构，其表面保留基底膜某些蛋白成分，是一种天然真皮替代物，能够诱导表皮的发育和分化。 2、在去表皮的真皮组织上发育和分化的新生表皮表现人体表皮的结构特征，有基底层、棘层、颗粒层及角质层。在表皮角质形成细胞间存在桥粒结构。在基底膜的表皮侧存在半桥粒结构。 3、新生表皮表达角质形成细胞分化蛋白标志如K1，K14，包膜蛋白，与表皮发育有关的重要蛋白分子如TGase 1，β1-整合素以及组织细胞增殖标记物如Ki67抗原，Brdu阳性细胞，Hoechst33258。 4、用细胞荧光素FDA及CMFDA结合荧光显微镜和计算机成像系统，荧光定量检测表皮生长面积。 5、该模型提供了模拟在体皮肤损伤修复过程，即皮瓣边缘角质形成细胞分裂增殖，向真皮替代物(DED)表面移行，最后覆盖DED，新生表皮完成修复和重塑的过程。 6、表皮生长因子促进表皮的增殖，移行和修复，较高浓度的倍他米松戊酸酯抑制表皮增殖。
【图文】：

紫红色,表面,中性粘多糖,PAS反应

1、DED表面存在基底膜带 (basementmembranezone，BMZ):经PAS染色，可见在凹凸不平的DED表面存在一条紫红色带，显示PAS反应阳性。说明DED的表面含有较多量的中性粘多糖。(见图1)。用免疫组化的方法显示在DED相同部位有1V胶原的着色(见图2)。说明DED的表面存在基底膜蛋白成分。

免疫组化,胶原,表面

在DED表面有IV胶原的均匀着色(IV胶原免疫组化，ABC染色x100)
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R-332

【参考文献】