【摘要】： 目的:近年来的研究发现,哺乳动物细胞质膜中存在着一些脂质组成特异、有序的局限性结构,这些膜异质性区域被称为“微区”(microdomain)或“脂筏”(lipid raft)。而小窝(caveolae)因为具有烧瓶底型凹陷的形态和特殊的标记蛋白小窝蛋白(caveolin)成为脂筏重要的一个亚类,与其它类型的脂筏相区别。研究表明,脂筏参与了许多细胞外信号跨膜传递的过程,为膜外分子与膜受体结合提供一个微环境。同时脂筏或小窝还介导了细菌、病毒甚至细菌毒素、朊病毒等感染细胞,成为近年来微生物领域研究的重点。要研究脂筏的作用,其前期工作就是分离提取纯化脂筏并对其进行鉴定。本课题组已在实验室成功分离脂筏,并经鉴定证实,为今后的研究工作奠定坚实的基础。此外,本课题组选用副粘病毒科成员副流感病毒-3(HPIV-3)和新城鸡瘟病毒(NDV)初步探讨了脂筏与病毒感染的关系,以期为今后找到不同病毒通过脂筏入胞的共性,寻找新的抗病毒药物靶点,深入了解细胞内吞的机制打下基础。 方法: 1、脂筏的分离提纯与鉴定: 所有操作步骤均在0-4℃下进行。对照组用15mM甲基-β-环糊精预处理,其它操作步骤与实验组相同。两组细胞数均约为2×10~8个,离心收集细胞沉淀,在细胞团中加入裂解缓冲液,混匀后用Dounce匀浆器轻打10次,再放入冰盒上裂解30min后离心,离心后的上清为去核液约1ml,向去核液中加入2ml 60%的OptiPrep,使其终浓度为40%,将以上稀释物小心放入离心管底部,用细胞裂解缓冲液稀释OptiPrep,使其终浓度分别为30%、25%、5%。按从高到低的顺序逐层加入到离心管中,每个梯度均为2ml。4℃下超速离心,100 000g,5h。从上到下依次收集离心样品9份,每份约1ml,行免疫印迹分析。 2、脂筏介导HPIV-3和NDV入胞的初步探讨 (1)HPIV-3和NDV分别经鸡胚增殖后测定效价, HPIV-3为1:640,NDV为1: 1280。并测定两种病毒的TCID_(50): HPIV-3的TCID_(50)为10~(-4.2)/0.1ml;NDV的TCID50为10~(-5.3)/0.1ml。 (2)以CPE为指标观察药物干预后病毒对细胞的感染性:分别以浓度5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L的甲基-β-环糊精37℃作用于MDCK细胞单层30min,之后以100TCID_(50)/0.1ml的HPIV-3或NDV 37℃吸附1.5h,于37℃,5%CO2孵箱培养4天。每日观察特征性细胞病变(CPE)。按统计学方法计算各组药物处理后病毒感染细胞的百分比。 (3)以蚀斑法测定药物干预后病毒对细胞的感染性:配制含0.75%琼脂的无酚红RPMI1640 50℃保温备用。分别用5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L甲基-β-环糊精处理MDCK细胞单层30min,之后感染10~(-5)的HPIV-3和10~(-7)NDV, 37℃吸附1.5h,加第一层琼脂,室温固化后置37℃5%CO_2孵箱培养3天,第4天铺第二层含中性红的琼脂培养基,避光培养数小时或过夜,倒置显微镜下计数蚀斑数,并进行统计学分析。 (4)小窝形态和NDV吸附细胞部位的电镜观察。 结果: 1、经离心和免疫印迹实验,脂筏主要位于25-30%密度梯度离心界面中,存在于收集样品中的第5、6、7管。小窝蛋白-1的分子量约为24KD,而对照组第5、6、7管未发现小窝蛋白-1。 2、以CPE为指标观察药物干预后病毒对细胞的感染性:甲基-β-环糊精对两种病毒感染细胞均有一定抑制作用,且随着剂量的增加效果明显提高。 3、以病毒蚀斑为指标观察药物干预后病毒对细胞的感染性:经统计学分析, 10mmol/L甲基-β-环糊精和15mmol/L甲基-β-环糊精处理后病毒感染细胞的抑制效果均有统计学意义(p㩳0.01)。尽管从数据上看NDV似乎更依赖脂筏进入细胞,但两种病毒之间对通过脂筏感染细胞的区别没有统计学意义。 4、透射电镜下可见形态各异的凹陷状小窝。NDV感染30分钟,病毒吸附于细胞膜上一个小窝状的凹陷内,同一时间段也观察到一个病毒被一囊泡膜包裹在细胞质中。 结论:本课题组采用密度梯度离心方法对哺乳动物细胞的脂筏成分进行了成功的分离纯化和鉴定,为今后进一步研究病毒特异性成分与脂筏的关系打下坚实的基础。同时我们也初步证实了NDV的感染是小窝介导的,HPIV-3感染细胞与脂筏相关。
【图文】：
图 1. 右侧为蛋白质 marker,从右侧数分别为第 1-9 管样品。由图可见，棕色沉淀主要在 3、4、5 泳道，而以第 4、5 泳道颜色更深。小窝蛋白-1 的分子量约为 24KDa
图 1. 右侧为蛋白质 marker,从右侧数分别为第 1-9 管样品。由图可见，棕色沉淀主要在 3、4、5 泳道，，而以第 4、5 泳道颜色更深。小窝蛋白-1 的分子量约为 24KDa图2. 左侧为蛋白相对分子质量标准;第一泳道为对照实验,经甲基-β-环糊精处理,结果为阴性;第二泳道为去垢剂不溶组分,在相对分子量24KDa处可见一棕色条带
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R373
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5 朱勇U
本文编号：2534894
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