土拨鼠CTLA-4胞外段与HBc融合DNA疫苗的构建、真核表达和小鼠免疫

发布时间：2019-09-28 02:31

【摘要】： 目的构建一个新的土拨鼠细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(wCTLA-4)胞外部分和人乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)融合蛋白的表达质粒pwCTLA-4-HBc,并检测其编码的融合蛋白在真核细胞中的表达和分泌情况,初步鉴定其在小鼠体内诱导相应抗体生成的情况。为揭示其作用机制和进一步用于慢性患者免疫治疗奠定基础。方法以德国埃森大学医学院病毒所构建的表达wCTLA-4与全长土拨鼠嗜肝病毒核心抗原(WHc)融合蛋白的质粒pCTLA-4-C为模板,通过PCR获得wCTLA-4胞外段和WHc前149位氨基酸融合蛋白编码基因片段。pcDNA3.1/V5-His?TOPO?TA表达载体克隆获得带有V5-His标签的表达质粒pwCTLA-4-WHc。经酶切鉴定和转染幼仓鼠肾(BHK)细胞,间接免疫荧光方法检测融合蛋白表达,证实其构建成功。根据设计的酶切位点,将其与含人乙型肝炎病毒核心抗原全长基因片段(HBc)的质粒pHcex同时双酶切,然后T4连接酶连接,以HBc基因片段置换pwCTLA-4-WHc质粒中的WHc片段。经双酶切鉴定插入片段大小方向正确,得到含土拨鼠CTLA-4蛋白胞外部分和HBc编码序列的带有V5-His标签的表达质粒pwCTLA-4-HBc。该质粒转染BHK细胞,间接免疫荧光方法(IF)检测融合蛋白的表达。转染人宫颈癌(Hela)细胞,细胞经温和裂解后收集上清与直接收集的细胞培养上清同时以化学发光微粒免疫法(CMIA)检测融合蛋白的表达。纯化质粒肌肉注射BALB/cJ (H-2d)小鼠双侧后肢胫前肌,共免疫三次。最后一次免疫3周后,眼眶静脉取血,分离血清,使用Enzygonost?抗-HBc/抗-HBe单克隆抗体试剂盒检测筛查免疫小鼠抗-HBc/抗-HBe抗体阳性率。结果融合蛋白重组质粒pwCTLA-4-HBc经双酶切后均可获得预期大小片段,重组体转染的BHK细胞可检测到HBc抗原特异性免疫荧光,pwCTLA-4-HBc转染Hela细胞后细胞裂解液和培养上清中针对HBeAg的CMIA反应呈强阳性,其中培养上清中抗原的相对浓度为细胞裂解液中的10倍。3次免疫结束后第二周末,wCTLA-4-HBc融合蛋白表达质粒免疫组4只动物中,有2只产生了针对HBcAg特异性的抗体(抗-HBc阳性率50%),其中一只的血清也可检测到抗-HBe(抗-HBe阳性率25%)。结论成功构建wCTLA-4胞外段和HBc融合蛋白表达质粒pwCTLA-4-HBc;wCTLA-4-HBc融合蛋白可以在脂质体介导下在真核细胞表达并可大量分泌到细胞外培养上清中;表达质粒pwCTLA-4-HBc免疫小鼠可以诱导产生针对HBcAg/HBeAg的抗体应答。
【图文】：

片段,目的,凝胶,质粒

ex 选用限制性内切酶 EcoR V 和 Xho I 双酶切后凝胶5．凝胶回收目的片段大小正确质粒pwCTLA-4-WHc和pHc回收目的片段：含 wCTLA-4 的载体片段和 HBc，琼脂糖凝胶电泳显示为特性目的条带，大小与预期相符。片段用于 T4 连接酶连接构建 pwCTLA-4-HBc 达质粒。wCTLA-4-WHc K5 200× wCTLA-4-WHc K6 200×c 融合蛋白在图 5 wCTLA-4-WH BHK 细胞中表达M 1 2

序列,质粒,片段,长度

华中科技大学同济医学院 6．双酶切因 DNA 片段，长度为 549bps；Kpn I 和外段编码 DNA 的片段，长度为 524bps，161 个氨基酸的编码 DNA；Kpn I 和 Xho序列全长的 DNA 片段，，长度为 1073b wCTLA-4 胞外段和 HBc 融合蛋白表根据设计，EcoR V 和 Xho IpsM1 2 3
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R392;Q78

【参考文献】