丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因载体的构建及其在真核细胞中的表达

发布时间：2019-09-30 13:05

【摘要】：目的:进行丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因真核表达载体的构建,并分析鉴定其在体外培养的人肝细胞QSG7701中的表达。 方法:用PCR方法从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM/HCV1-3011表达载体中扩增出HCV NS3基因片段,将其与表达载体pcDNA3.1(-)重组,得到重组的真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3。然后采用阳离子多聚体介导法将其转染人肝细胞QSG7701,以免疫组织化学SP法检测到细胞中NS3蛋白表达阳性后,即用G418筛选出可稳定表达HCV NS3蛋白的系统。对稳定表达的细胞提取其细胞质蛋白,用SDS-PAGE电泳及Western Blotting印迹法检测细胞表达的HCV NS3蛋白。 结果:所得到的NS3片段大小正确,序列正确,并在两端成功插入起始、终止密码子和EcoRI、BamHI酶切位点。所构建的真核表达质粒成功转染QSG7701细胞并可稳定表达HCV NS3蛋白,表达的特异性NS3蛋白分子量为预期的70000。 结论:成功构建了丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/NS3,并且该载体在体外培养的人肝细胞中能稳定有效地表达分子量正确的特异性HCV NS3蛋白,从而为进一步研究HCV NS3基因诱发不死化人肝细胞癌化的机制奠定了基础。
【图文】：

peDNA3.(l一)(.54k句质粒图谱

上游引物:GAAITC户a，，GGCGCCC户口，CACGGCGI人CGC，引入了EcO石梦酶切位点和翻译起始密码子户JG。下游引物:CTGGACCTCCAGCAGTGCA门，CCI，AGG，引入了BamHI酶切位点和翻译终止密码子户丁1，。PCR引物由上海生工生物科技公司合成。三.特异性抗体一抗HCvNs3单克隆抗体购自美国Boidesing公司。辣根过氧化物酶标记的驴抗羊二抗购自上海康成生物工程有限公司。四.质粒重组质粒pBRTM肚vcl一3011由美国华盛顿大学Rcie教授惠赠，含有HVC全长基因序列。空白表达载体peDN户3.1〔)由我校生命科学学院孙奋勇博士惠赠，含有CMv启动子位于多克隆位点前，复制起始点Sv40ori，抗氨节青霉素及抗G418基因。克隆载体pGEM一T购自S烤ma公司。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R373

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本文编号：2544307