抗AFP重链可变区单域抗体融合蛋白的构建、表达及初步鉴定

发布时间：2019-09-30 14:44

【摘要】：目的构建抗甲胎蛋白(AFP)重链可变区(VH)单域抗体融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达,并初步鉴定表达产物的活性。方法从已构建的抗AFP单链抗体(ScFv)的载体中,经PCR扩增出VH单域抗体基因,再克隆到融合蛋白表达载体pET32a(+)中进行表达;用SDS-PAGE及Western-blot鉴定表达产物;并通过竞争抑制ELISA分析TrxA-VH融合蛋白的结合活性;细胞免疫组化染色分析其内化及结合情况。结果VH单域抗体基因全长339 bp,将其克隆到pET32a(+)中,转化大肠杆菌可获得高效表达,Western-blot证实在相应分子质量处,有TrxA-VH融合蛋白的显色条带。经初步纯化和复性后,获得抗AFP的VH单域抗体融合蛋白。竞争抑制ELISA及细胞免疫组化证明,表达产物具有与AFP特异结合的活性。结论成功构建了抗AFP的V单域抗体融合蛋白,为临床的应用研究奠定了基础。
【图文】：

条分子量约33 kD的新生蛋白带,与空质粒表达产物TrxA蛋白相对分子量(19 kD)和单域抗体相对分子量(14 kD)之和相近(图1)。252　华西药学杂志　　　第22卷

样品与细胞共孵育,同样显示出阳性,但较A组弱;对照组呈阴性。说明TrxA-VH融合蛋白能够与AFP结合,并且具有进入胞内的能力(图3)。图3　免疫组化检测A、B组和对照组(C)TrxA-VH融合蛋白的结合及进入胞内的能力Fig 3　Identification ofTrxA-VHfusion protein ofA group(A), Bgroup(B) and control group(C) by immunocytochem istry1.3.4　单域抗体融合蛋白的Western-blot鉴定　图4显示:在相对分子量为33 kD的附近有明显的诱导条带生成,虽然Western-blot显色时有非特异的条带出现,但是33 kD处的条带最强,并且不出现于未诱导的菌体中。说明是与His-tag抗体特异性结合的VH单域抗体融合蛋白。图4　TrxA-VH单域抗体融合蛋白的表达(W estern-blot分析)Fig 4　Identification of expression of TrxA -VHfusion protein byW estern-blot1.3.5　竞争抑制ELISA检测抗体的活性　将单域抗体融合蛋白依次4倍稀释,与单克隆抗体通过竞争抑制ELISA来检测其抑制率,得抑制曲线。由图5可知,单域抗体滴度为1/64时便可抑制50%的单克隆抗体与抗原结合。说明抗AFP单域抗体融合蛋白具有良好的抗原结合能力。图5　竞争抑制ELISA曲线Fig 5　The curve of competitive inhibition ELISA1·3·6　VH基因的扩增　以已构建的抗AFP单链抗体载体为模板进行PCR扩增
【作者单位】： 四川大学华西基础医学与法医学院免疫学教研室 四川大学华西基础医学与法医学院免疫学教研室 四川大学华西基础医学与法医学院免疫学教研室 四川大学华西基础医学与法医学院免疫学教研室 四川大学华西基础医学与法医学院免疫学教研室
【基金】：四川大学科技创新基金资助项目(No.2004CF09)
【分类号】：R392.12

【参考文献】

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本文编号：2544337