淋巴细胞迁移对移植免疫反应影响的实验研究

发布时间：2019-10-01 21:18

【摘要】： 前言移植免疫排斥问题始终是困扰器官移植界及免疫学界的一个难题。免疫抑制剂的应用带来一系列问题，如感染、肿瘤高发等。通过各种手段使患者摆脱移植后的长期药物的依赖，免除免疫抑制剂的使用或最大程度地减少药物的剂量，达到移植物与受者的长期良好存活，是移植领域的最终目标。细胞迁移过程是研究器官移植免疫反应的一个重要课题。近年来趋化因子在细胞迁移过程中的作用得到了充分的重视，认为淋巴细胞的迁移在很大程度上受到趋化因子的影响。目前淋巴细胞向二级淋巴器官的迁移过程已经被逐渐阐明，这是一个多步骤的联级反应，受到多种因子的调控。其中淋巴细胞表面的CCR7与配体CCL19、CCL21的相互作用起到极为重要的作用，是淋巴细胞进入淋巴结的关键。在二级淋巴器官内部，CCR7与CCL19的作用继续维持淋巴细胞的游走。另外树突状细胞的迁移也受CCR7及配体作用的调控。CCR7基因敲除小鼠(CCR7~(-／-))是由德国的F(?)rster教授于1999年制备成功，CCRT~(-／-)小鼠最大的特征是由于CCR7的缺失，导致淋巴细胞迁移功能的损害，使其向二级淋巴组织归巢的过程受阻。最初的研究表明，受者的二级淋巴器官在免疫排斥反应中是必需的。Lakkis等的实验发现缺乏二级淋巴器官的aly／aly小鼠无法排斥同种异体的心脏移植物。但是最近Zhou等在另两种淋巴结缺失的LTα~(-／-)和LTβR~(-／)小鼠中却发现，虽然异体心脏与皮肤移植物在这两种受者中存活时间明显延长，但是却并未达成耐受状态。另外，plt／plt小鼠是缺乏CCR7配体CCL19与CCL21的基因敲除小鼠，其二级淋巴器官也是空虚的。移植结果同样表明，心脏移植物的存活时间得以有限延长，但耐受状态却并不存在。上述结果均提示了二级淋巴器官在移植排斥过程中并非必须，但这些研究均是在二级淋巴器官缺失的基因敲除小鼠中进行，尚少见在淋巴细胞迁移受体缺失的受者中进行的研究。如CCR7~(-／-)小鼠，其淋巴细胞与树突状细胞因缺乏CCR7而无法迁移至淋巴结内，仅能在外周组织中循环，其效应与淋巴器官缺失是类似的。因此，本研究是在CCR7~(-／-)小鼠基础上进行一系列的移植研究实验，总体而言分为四个方面的探索：一、以CCR7~(-／-)小鼠作为受者，研究淋巴细胞迁移障碍的受者对同种异体移植物的排斥情况及耐受状态是否达成。二、以CCR7~(-／-)小鼠作为供者，其供者器官内的树突状细胞无法游走迁移到受者的二级淋巴器官，从而在理论上无法递呈供者抗原，以研究这一状态下的器官移植排斥状态。三、以CCR7~(-／-)小鼠分别作供受者，以研究这两种效应结合对移植物存活与排斥反应的影响。四、采用经典的免疫诱导方案研究CCR7的缺失对移植免疫耐受状态的影响。小肠移植(small bowel transplantation，SBTx)是治疗不可逆小肠功能衰竭的有效手段，由于小肠的免疫原性很高，且富含淋巴组织及肠道菌群，可以导致很难控制的排斥反应。与其他的实质性器官移植相比较，临床小肠移植依然未取得满意的结果。因此，迫切需要寻求一种高效、低毒、高度特异性的治疗方案，以减少小肠移植的排斥反应。 FTY720是一种新型免疫调节剂，其作用是可以促进外周淋巴细胞进入二级淋巴器官，从而导致外周血中淋巴细胞减少，起到免疫调节作用。FTY720的药物特性，使促进淋巴细胞迁移的手段应用于免疫耐受的诱导与调节成为可能。共刺激通道阻断剂是广泛使用的免疫耐受手段，其中CD40-CD40L(MR1为抗小鼠CD40L单抗)通道阻断是最为常用与最为有效的方法。在一系列的小鼠移植模型中，MR1联合DST均能有效地诱导免疫耐受，但是在小鼠的SBTx中，小肠移植物的存活均未得到改善。 CD40-CD40L共刺激通道阻断方案诱导免疫耐受的依赖于T淋巴细胞进入到二级淋巴器官。我们在成功建立小鼠小肠移植模型的基础上，试图验证这样的假设：运用FTY720促进T淋巴细胞进入二级淋巴器官，并延长其滞留时间，同时联合CD40-CD40L共刺激通道阻断，以增强诱导小肠移植物免疫耐受的效果。材料与方法第一部分：趋化因子受体CCR7缺失对同种异体移植免疫反应的影响 1．实验动物分组：分别以CCR7~(-／-)小鼠作为移植供者或受者，以及CCR7~(-／-)小鼠同时作为供受者进行同种异体移植。 2．小鼠心脏移植采用腹部异位移植方法。 3．小鼠皮肤移植采用背部移植方法。 4．小鼠心脏移植物病理组织学分析包括光镜下HE染色，CD4与CD8免疫组织化学染色。 5．受者小鼠局部引流淋巴结内的淋巴细胞表型分析，采用流式细胞法，通过CD4、CD8、B220染色并计数。第二部分：FTY720联合共刺激通道阻断抑制小鼠小肠移植的排斥反应 1．实验动物分组：供者小鼠为C3H小鼠(H-2~k)，受者小鼠为C57BL／6小鼠(H-2~b)。分为空白对照组，MR1单独治疗组，FTY720单独治疗组，FTY720与MR1联合治疗组。MR1在术后当天给予静脉注射500μg，相同剂量的药物在术后d2、4、7经腹腔注射给药；FTY720每日按1mg／kg剂量灌胃。 2．小鼠小肠移植采用腹部异位移植方法，远端与受者小肠吻合。 3．移植物病理组织学评估采用移植后6d与14d，分别取移植肠HE染色，光镜下观测移植物形态并行移植物排斥评分。 4．小肠移植物各部分淋巴细胞的分离，包括IELs，LPLs，MLNs及PPs，采用胶原酶A消化，EDTA解离及密度梯度离心法。 5．流式细胞分析采用分离获得的淋巴细胞，分别经大鼠抗小鼠CD4、CD8、CD19、CD69、CD25单抗孵育染色，流式细胞仪上机读取结果并分析。 6．多重免疫荧光染色分别由H2-Kb，，CD3，B220单抗孵育染色，在荧光显微镜下读片并进行图像合成。结果第一部分：趋化因子受体CCR7缺失对同种异体移植免疫反应的影响 1．同种异体皮肤及心脏移植物在CCR7~(-／-)小鼠中存活时间延长。 2．移植物的病理学分析发现CCR7~(-／-)小鼠的心脏移植物中浸润的单核细胞明显减少。 3．流式细胞分析结果表明CCR7~(-／-)小鼠中移植物局部引流淋巴结的T细胞与B细胞的增殖速度与数量明显小于野生型小鼠。 4．CCR7~(-／-)供者移植物在野生型受者中的存活时间无明显延长。供受者均为CCR7~(-／-)小鼠，也未达成免疫耐受。 5．小剂量CsA治疗对CCR7~(-／-)小鼠并无协同作用，反而消除了后者心脏移植排斥的延缓作用。 6．CCR7~(-／-)小鼠行脾切除对移植物无保护作用。 7．经典的耐受诱导方案CD40-CD40L通道阻断联合DST在CCR7~(-／-)小鼠中无法诱导心脏移植物免疫耐受。第二部分：FTY720联合共刺激通道阻断抑制小鼠小肠移植的排斥反应 1．小鼠小肠移植模型成功建立，手术成功率90％以上。 2．FTY720与MR1联合治疗对小鼠小肠移植排斥反应有明显的抑制作用，但FTY720与MR1的单独治疗均无效果。 3．FTY720与MR1联合治疗显著减少受者外周淋巴细胞数量。 4．FTY720减少移植物MLNs和PPs中受者CD4~+淋巴细胞的数量，但不影响CD8~+淋巴细胞。 5．FTY720和MR1联合治疗明显抑制CD8~+淋巴细胞在移植物LPLs中的浸润。 6．FTY720和MR1联合治疗抑制移植物内宿主淋巴细胞的活性，CD44阳性细胞明显减少。 7．FTY720抑制小鼠小肠移植物内的CD11b~+Gr1~+单核细胞的浸润。结论 1、同种异体移植物在CCR7缺失的受者中存活时间延长，仍可引起免疫排斥反应。经典的免疫耐受方案无法在CCR7缺失的小鼠中诱导移植耐受。 2、FTY720联合CD40-CDC0L共刺激通道阻断可以有效抑制小鼠小肠同种异体移植物的排斥反应。机制可能是通过减少受者淋巴细胞向移植物浸润并抑制其激活，尤其减少受者CD8~+淋巴细胞向移植物固有层的浸润。
【图文】：

受者,T淋巴细胞,内相,互作用

川10二.一.…‘-.灯.姻日豪扣z一‘.、二，，叹..…从。g吐;.矛‘·言::’:，i.，八‘ti切 atedTeells图1(l)在ccR7一人小鼠中，受者T淋巴细胞无法进入二级淋巴器官，因此无法与供者的Dc在淋巴结内相互作用，可能影响移植杭原的提呈.(2)在ccR7不的供者器官中，供者Dc迁移功能受领，因此无法进入受者二级淋巴器官，可能影响移植抗原的提呈。(l)与(2)在供受者均为ccR7一J.鼠时，供者Dc与受者T淋巴细胞均不能进入二级淋巴器官，因此可能进一步影响材料与方法一、实验动物与分组C3H小鼠(H一Zk)

受者,无差异,野生型,受体

ccRv-/一受者的心脏移植物内cD4+与cDS十阳性淋巴细少于野生型受体，但移植后6d，上述细胞的浸润情况无差异。(*CCR7一小鼠皮肤移植物局部引流淋巴结内的细胞增殖反应为了进一步明确在CCR7子小鼠中皮肤移植物排斥减缓的机制，我们移植物局部引流淋巴结内的淋巴细胞的增殖反应。在CCR7一小鼠的植C3H的皮肤后4d与7d，我们获取其局部引流淋巴结进行流式细胞表明ccR7一小鼠中局部的T细胞与B细胞的增殖速度与数量明显小但淋巴细胞激活标记CD25并未有显著变化。在野生型小鼠，甚至肤移植也可激发局部淋巴结内细胞的快速增殖，而CCR7一人小鼠中，细胞扩增数量明显减少，与排斥减缓现象一致。见图6。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

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