乙醇对脑内5-HT能体系和DA能体系影响的实验研究

发布时间：2019-10-09 12:21

【摘要】： 随着经济的发展、人们交往的增多,酒的消费也显著增加。酒促进交往的同时,经皮肤、呼吸道、消化道吸收,引起机体心血管系统、消化系统,特别是神经系统的损害,后者常常表现为抑郁、记忆力减退以及运动功能障碍等症状。流行病学研究发现,抑郁症近年呈明显的上升趋势,这除了与生活压力增加、工作紧张等原因有关外,饮酒也很可能是部分人群产生抑郁的原因之一。有学者研究发现抑郁患者出现5-羟色胺(serotonin,5-HT)体系的功能障碍,表现为5-羟色胺转运体(serotonin transporter, SERT)的明显减少。SERT是位于5-HT能神经末梢的一种膜蛋白,通过再摄取突触间隙的5-HT而终止5-HT的作用;它的降低除反映5-HT能神经元的功能障碍外,还提示5-HT神经元所支配脑区内5-HT能神经纤维数目的减少。因此SERT是研究5-HT能神经元功能状态的重要指标。中脑边缘多巴胺能体系(mesolimbic dopaminergic system)在药物成瘾过程中起着十分重要的作用。脑内多巴胺(dopamine, DA)能神经元的功能活动有赖于多巴胺转运体(dopamine transporter, DAT)的正常表达。DAT是位于DA能神经末梢突触前膜上的膜蛋白,能够特异性的识别DA,将释放到突出间隙的神经递质- DA快速的再摄取到突触前神经末梢内,从而终止神经信息的传导。研究发现DAT是可卡因等一些精神兴奋药物的作用靶点。有学者通过对可卡因成瘾者的尸检材料研究发现,可卡因成瘾者脑内纹状体DAT结合位点明显增加;动物实验进一步证实了DAT结合点增加的结果。这些研究均提示DAT是可卡因成瘾的一种状态指标。酗酒成瘾是否也如可卡因等精神兴奋药物一样提高DAT的表达,目前尚无研究。本研究利用免疫放射自显影法、免疫细胞化学、形态测量学、免疫印迹、流式细胞技术及透射电镜等方法,通过对酗酒人脑标本及乙醇处理大鼠5-HT能和DA能体系不同脑区的研究,分析酗酒和乙醇对SERT和DAT表达的影响,期望为酗酒者症状的解释及酒精成瘾提供实验形态学依据。第一部分:SERT在人脑不同区域分布的免疫放射自显影研究目的:定量分析人脑标本不同区域内SERT的免疫反应强度,1.为研究酗酒人脑标本SERT蛋白的改变提供适宜的观察部位和实验数据; 2.为临床应用SERT配基检测抑郁等疾病选择参照区提供神经解剖学依据。方法:收集5例男性人脑标本,依据人脑图谱定位、取脑,尔后切成3～5mm厚的脑片,经甲醛固定、常规脱水、透明、石蜡包埋,开始切片进行免疫放射自显影研究,显影、定影,以Luxol Fast Blue复染切片,扫描仪扫描胶片(300dpi),以TIFF格式储存,用AIS软件测量感兴区密度即SERT免疫反应强度(显微镜下观察复染切片,用鼠标勾画图像相应核团边界,以125I-standards校正的14C-standards曲线,测量边界内图像密度,计算胶片图像与切片对应核团的125I强度。所得值减去对照组相同核团背景标记值为特异性标记结果(nCi/mg)。结果:1. SERT标记一般观察所观察的脑区中,SERT免疫反应强标记信号主要分布在脑干的中缝核区及中脑黑质;在端脑的壳核、尾状核以及扣带回(特别是膝周皮质)也存在SERT标记信号,强度明显低于前者;端脑的额叶、枕叶SERT标记信号较弱,小脑皮质在观察脑区中SERT免疫反应强度标记最低;2. SERT标记强度分析所观察的各个脑区SERT免疫反应强度的测量结果显示,中缝背核为2.99±0.89,黑质为1.73±0.36,尾状核为0.31±0.07,壳为0.28±0.06,额叶皮质为0.11±0.05,枕叶皮质为0.13±0.08,扣带回为0.55±0.02,小脑皮质为0.06±0.04。小脑皮质是各个脑区SERT免疫反应强度标记最低的部位,仅占中缝背核、黑质、尾状核、壳、额叶皮质、枕叶皮质及扣带回的1/49.83、1/28.83、1/5.17、1/4.67、1/1.83、1/2.17和1/9.17。结论:1. SERT蛋白在5-HT能神经元投射源区中以中脑中缝背核表达最高。在5-HT能神经元投射靶区中以中脑黑质、腹侧被盖区表达最明显;扣带回前部膝周皮质次之;小脑皮质和胼胝体表达最低。2.小脑皮质含有极少量SERT蛋白,如果放射性配基选择适当,应是临床配基显像技术检测SERT变化诊断相关疾病的理想参照区。第二部分:SERT在酗酒人脑标本的表达改变目的:观察酗酒人脑标本不同区域内SERT免疫反应强度,判定SERT蛋白含量的改变。方法:收集10例男性脑标本,对照组和酗酒组各5例,其余同上。结果:1. SERT标记一般观察所观察的脑区中,健康组人脑标本SERT强标记信号在脑桥头侧主要集中分布在与中缝核群相同的位置,在脑桥基底部和被盖的其它区域的标记信号散在且较弱;在中脑水平除中缝核群所处位置的SERT强标记信号外,红核周围以及黑质的标记信号也较强;在扣带回SERT强标记信号主要分布于其前部特别是膝周皮质。上述SERT的标记信号强度在酗酒组的相同脑区呈现不同程度的减弱。2. SERT标记强度分析定量分析发现SERT免疫反应含量强度分别为,健康组中缝正中核(median raphe nucleus,MnR)1.89±0.62、中缝背核(dorsal raphe nucleus,DRN)的中缝背核束间部(dorsal raphe nucleus - interfascicular part,DRI)2.32±0.89、中缝背核尾侧部(dorsal raphe nucleus - caudal part,DRC)2.54±0.42、中缝背核腹侧部(dorsal raphe nucleus ventral part,DRV)3.26±0.98、中缝背核背侧部(dorsal raphe nucleus dorsal part,DRD)2.66±0.77、中脑黑质(substantia nigra,SN)1.73±0.36和扣带回前部膝周皮质(pregenual anterior cingulate gyrus)0.55±0.02;酗酒组MnR、DRI、DRC、DRV、DRD、SN和扣带回前部膝周皮质的SERT免疫反应含量强度分别为0.76±0.16,0.90±0.34,1.17±0.39,1.34±0.09,1.10±0.25、0.82±0.23和0.43±0.04。酗酒组SERT免疫反应含量强度显著均低于健康对照组(DRI、DRC、SN与扣带回前部膝周皮质:P㩳0.01;MnR、DRV及DRD:P㩳0.05),数据有统计学意义。脑桥网状核嘴侧部(pontine reticular nucleus - oral part,PnO)、丘系上区(supralemniscal region,B9)、中缝旁正中核(paramedian raphe nucleus,PMnR)以及腹侧被盖区(ventrotegmental area,VTA)的SERT免疫反应强度在酗酒组与健康对照组之间无显著差异(P㧐0.05)。结论:酗酒人脑标本中缝背核、黑质以及扣带回前部膝周皮质SERT蛋白表达减少,提示酗酒者脑内存在5-HT能神经活动的障碍。第三部分:乙醇处理对大鼠脑内5-HT能体系的影响目的:观察乙醇处理对大鼠脑内不同区域SERT、5-HT和TPH表达的影响,判断乙醇对脑内5-HT能神经体系的损害。方法:选取3月龄体重为250—300 g Wistar大鼠120只,雄性(河北医科大学实验动物中心提供),随机分为对照组和乙醇处理组,对照组给予正常饮食饮水,乙醇处理组给予正常饲料,以20%酒精代替饮水。各组实验动物分别饲养6个月。1.免疫组织化学研究:深麻醉下,经左心室-升主动脉灌注生理盐水100 ml,4℃4%多聚甲醛400 ml 1 h,开颅取脑,后固定4 h,蔗糖溶液4℃过夜。按需要把脑块行冠状位切片,免疫组织化学染色。①PB洗片;②抗原修复;③3% H2O2及80%甲醇灭活;④10%正常羊血清室温封闭;⑤入特异性I抗兔抗SERT多克隆抗体(1:10000)、兔抗5-HT多克隆抗体(纹状体1:5000、中脑1:8000)、小鼠抗TPH的单克隆抗体(1:1000)4℃孵育;⑥分别入1:500生物素化的羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG室温孵育;⑦入1:500的辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素室温孵育;每步间以TBS洗片3次,每次5 min;⑧DAB呈色、贴片、封片。光学显微镜下分别计数脑干中缝背核(B7)TPH和5-HT免疫反应神经元数目;测量TPH免疫反应神经元平均直径;用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统分析所观察脑区5-HT能免疫反应神经元或纤维各个指标(5-HT、TPH和SERT)的静态灰度值。2.流式细胞学检测:将所需大鼠直接断头取脑,于冰板上取所需脑组织,放在120目不锈钢网上,边搓边用生理盐水冲洗,过滤、收集细胞悬液,500-800转离心制备单细胞悬液。取单细胞悬液1×106/ ml,分别加入1:100鼠抗TPH单克隆抗体、兔抗SERT的多克隆抗体及兔抗5-HT的多克隆抗体各0.1 ml,室温孵育, PBS洗涤,弃上清,分别加入羊抗鼠异硫氢荧光素(FITC-IgG)及羊抗兔藻红素蛋白(PE-IgG)二抗工作液各0.1 ml,避光室温孵育,加入PBS 10 ml离心同上,弃上清,加入PBS 0.1 ml经500目铜网过滤后上机检测,电脑记录,计数SERT、TPH和5-HT的表达量X-mode值。3. Western-Blot检测:所需大鼠断头取脑,冰板上用刀片取所需脑组织,加入蛋白裂解缓冲液,放入0℃水浴研磨,静置1 h,4℃、15000 r/min离心25 min,取上清液。以考马斯亮蓝液在紫外-可见分光光度计上进行蛋白质定量,蛋白质浓度(mg/ml)=样品光密度值/标准管光密度值×2.5,蛋白样品分装,-80℃保存。①配制分离胶;②配制浓缩胶,清洗上样孔,加入电泳缓冲液,加样品;③进行(120V)电泳3 h;④电转移2 h至PVDF膜;⑤免疫显色: 5%脱脂奶粉封闭2 h,1:500稀释的小鼠抗TPH单克隆抗体、兔抗SERT多克隆抗体,4℃过夜,1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔或小鼠IgG37℃孵育1.5 h,ECL(增强化学发光)试剂A液和B液滴加于膜上反应1 min,将PVDF膜放入x光片暗盒,显影,定影。底片经扫描仪透扫后,美国UVP公司LabWorks 4.5软件对Western条带进行定量分析,确定杂交条带的相对吸光度值。4.透射电镜观察:将大鼠以水合氯醛麻醉,用含有1.5%多聚甲醛和2.5%戊二醛的固定液经心灌注取脑,后固定2 h。以震动切片机行冠状位切片,收集含脑干中缝背核的切片,以1%的锇酸后固定1 h。脑片经梯度酒精脱水,丙酮置换后,以树脂平板加芯包埋。光镜下定位,取所要观察的脑干中缝背核部位,以超薄切片机切片60 nm,日立H-7500透射电镜观察,加速电压80Kv,采集电镜图像。结果:1.免疫组织化学结果:正常大鼠5-HT能免疫反应神经元集中在中脑下丘节段,棕褐色,胞体大小均一,呈椭圆或圆形。SERT在正常大鼠脑内分布呈粗细不等交叉成网的纤维状,在中脑主要分布在中缝背核,在端脑分布广泛,如扣带回、纹状体等。计数细胞数目结果显示,与对照组相比,乙醇处理组神经元数目明显减少,5-HT、TPH免疫反应神经元数目对照组中缝背核分别为24.57±0.70和24.86±1.28;乙醇处理组分别为15.89±0.67和16.00±1.00,两组间t检验有显著差异性(P㩳0.01);测量细胞直径结果显示,与对照组相比,乙醇处理组神经元直径明显变小,TPH免疫反应神经元直径对照组中缝背核为12.13±1.05μm,乙醇处理组为11.44±1.21μm,比对照组减小5.69%(P㩳0.01);腹外侧部对照组为11.84±1.50μm,乙醇处理组为10.82±1.69μm,比对照组减小8.61%(P㩳0.01);免疫反应染色灰度值结果显示,与对照组相比,乙醇处理组免疫反应染色灰度值明显升高,5-HT免疫反应染色灰度值在对照组中缝背核(B7)和纹状体分别为45.78±5.43和164.94±1.84,乙醇处理组分别为59.73±1.67和181.52±2.45,比对照组分别增高30.47%和10.05%(P0.05)。TPH免疫反应染色灰度值对照组中缝背核(B7)为88.80±1.29,乙醇处理组为106.48±6.92,比对照组增高19.91%(P0.05)。SERT免疫反应染色灰度值在对照组中缝背核(B7)、纹状体和扣带回分别为103.57±2.80、102.68±7.72和149.44±14.16,乙醇处理组分别为120.45±6.65、122.36±7.54和180.00±11.85,比对照组分别增高了16.30%、19.17%和20.45%( P0.05)。2.流式细胞学检测结果:流式细胞仪间接免疫荧光法显示,与对照组相比,乙醇处理组5-HT、TPH和SERT的表达量均明显降低,对照组中脑下丘节段5-HT、TPH和SERT的表达量分别为439.2±19.99,638.30±1.37和553.36±15.13;乙醇处理组分别为378.25±6.84,595.20±13.51和513.11±12.05,三组数据均具有统计学意义(P0.05)。3. Western-Blot检测结果:与对照组相比,乙醇处理组大鼠所观察脑区SERT与β-actin条带相对吸光度比值明显降低,对照组大鼠扣带回、纹状体和中缝背核分别为0.0034±5.69×10~(-5)、0.0034±8.97×10~(-5)、0.0037±1.33×10~(-4);乙醇处理组大鼠分别为0.0031±6.97×10~(-5)、0.0032±1.35×10~(-5)、0.0034±1.53×10~(-4);具有统计学意义(P0.05)。TPH与β-actin条带相对吸光度比值在对照组大鼠中缝背核为0.0056±1.25×10~(-4);乙醇处理组为0.0052±8.6×10~(-5)。数据具有统计学意义(P0.05)。4.透射电镜观察结果:经过对中缝背核5-HT能神经元进行观察发现,与对照组相比,乙醇处理组神经元溶酶体增多。结论:1.乙醇处理引起大鼠脑内中缝背核5-HT能免疫反应神经元数目减少、直径变小。2.乙醇处理导致5-HT能体系SERT、5-HT和TPH表达降低。3.乙醇处理引起中缝背核神经元超微结构改变。第四部分:乙醇处理对大鼠脑内DA能体系的影响目的:观察乙醇处理组大鼠脑内不同区域DAT和TH的表达变化,探讨酒精成瘾的可能机制,为戒断酒精成瘾提供实验依据。方法:同第三部分。1.免疫组织化学研究:一抗为大鼠抗DAT多克隆抗体和小鼠抗TH单克隆抗体,二抗为羊抗大鼠IgG和羊抗小鼠IgG,观察分析DA能免疫反应神经元或纤维TH和DAT,脑区为黑质、纹状体和扣带回,其余同第三部分。2流式细胞学检测:抗体为鼠抗TH单克隆抗体和羊抗鼠异硫氢荧光素(FITC-IgG),其余同第三部分。3. Western-Blot检测:所用抗体为小鼠抗TH单克隆抗体和大鼠抗DAT多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠或大鼠IgG,确定杂交条带TH和DAT的相对吸光度值。其余同第三部分。4.透射电镜观察:取出所要观察的部分中脑黑质,其余同第三部分。结果:1.免疫组织化学结果:正常大鼠脑内TH免疫反应阳性神经元主要集中在中脑黑质及腹侧被盖区,棕褐色,胞体圆形或椭圆形;DAT分布呈粗细不等交叉成网的纤维状,在黑质仅有较弱的阳性免疫反应标记。与对照相比,乙醇处理组TH免疫反应神经元数目明显减少、直径变小。TH神经元数目对照组为45.95±8.11;乙醇处理组为30.29±4.85,减少程度达34.08%(P㩳0.01);TH神经元对照组平均直径为10.16±1.53μm,乙醇处理组为9.31±1.22μm,比对照组减小8.37%(P㩳0.01);与对照相比,乙醇处理组各指标免疫染色灰度值降低。对照组大鼠黑质和纹状体TH灰度值为71.39±3.90和182.90±22.72,乙醇处理组为60.99±4.96和158.52±16.84,降低幅度分别达到14.57和6.66%(P0.05);DAT灰度值在对照组大鼠黑质、纹状体和扣带回为59.78±1.95、88.72±3.62和96±2.18;乙醇处理组为53.85±1.26、68.75±3.53和84.38±1.92,降低幅度分别达到9.92%, 22.51%和12.21%(P0.05)。2.流式细胞学检测结果:流式细胞仪间接免疫荧光法测得对照组中脑TH表达量为535.55±13.24;乙醇处理组为580.39±19.28,比对照组增高8.4%(P0.05)。3. Western-Blot检测结果:DAT与β-actin条带相对吸光度比值在对照组大鼠扣带回、纹状体、黑质为:0.0034±6.61×10~(-5)、0.0034±5.59×10~(-5)、0.0035±8.12×10~(-5);乙醇处理组为0.0036±3.14×10~(-5)、0.0037±8.95×10~(-5)、0.0037±4.16×10~(-5);比值增高3.84%,7.39%和5.6%,各组数据具有统计学意义(P 0.05)。TH与β-actin条带相对吸光度比值在对照组大鼠黑质和纹状体为0.0036±9.63×10~(-5),0.0035±1.17×10~(-4);乙醇处理组为0.0045±75.11.33×10~(-4),0.0041±6.29×10~(-5),比值增高23.16%和16.89%,说明TH蛋白表达量增加。数据具有统计学意义(P 0.05)4.透射电镜观察结果:经过对黑质DA能神经元进行观察发现,与对照组相比,乙醇处理组未见明显改变。结论:1.乙醇处理引起大鼠黑质DA能免疫反应神经元数目减少、细胞变小。2.乙醇处理引起大鼠脑内DAT表达增加,可能与酒精成瘾有关。第五部分:DAT在人脑不同区域分布的免疫放射自显影研究目的:定量分析人脑标本不同区域内DAT的免疫反应强度:1.为酗酒人脑标本DAT蛋白的研究提供适宜的观察部位和实验数据。2.为临床应用DAT配基检测或研究相关疾病参照区的选择提供神经解剖学依据。方法:同第一部分结果:1. DAT标记一般观察所观察的脑区中,DAT免疫反应强标记信号主要分布在中脑的黑质、端脑的壳及尾状核;另外端脑额叶、枕叶也可见弱的DAT标记;而小脑皮质标记信号最弱;2. DAT标记强度分析所观察脑区测量结果显示:DAT免疫反应强度在黑质为1.50±0.40,尾状核为2.10±0.26,壳为1.54±0.18,额叶皮质为0.63±0.38,枕叶皮质为0.23±0.02,扣带回为0.67±0.44,小脑皮质为0.18±0.15(Fig. 2, Table 1)。可以看出小脑皮质是各个脑区DAT免疫反应强度标记最低的部位,仅分别占黑质、尾状核、壳的1/8.33、1/11.67、1/8.56,而额叶皮质、枕叶皮质及扣带回DAT的标记强度则分别为小脑皮质的3.50、1.28、和3.72倍;小脑皮质DAT的标记强度更接近白质(胼胝体),其比值为1: 0.61。结论:1. DAT分布在黑质及其投射靶区,在尾状核、壳及黑质表达最高。2.小脑皮质含有极少量DAT蛋白,应是临床配基显像技术检测DAT变化诊断相关疾病首选的理想参照区。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R363

【参考文献】