有机硒对BCG免疫效果影响的初步探讨

发布时间：2019-10-12 19:08

【摘要】： 目的:1.构建表达结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的靶细胞,应用于CTL杀伤实验以评定结核疫苗的免疫效果。2.观察及监测有机硒与卡介苗联合运用于小鼠的安全性、脏器荷菌量,及诱导小鼠产生的特异性细胞免疫应答。3.从体外细胞水平探讨有机硒对受BCG感染后的巨噬细胞产生NO的能力、生存能力和处理细菌能力的影响。方法: 1.将携带有Ag85B基因的重组质粒pTB30s转入小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0),用RT-PCR及免疫组化染色法鉴定阳性克隆细胞内的Ag85B基因转录和蛋白表达水平,并以此阳性细胞作为CTL的靶细胞,用MTT法检测各组小鼠针对Ag85B的特异性CTL杀伤活性。 2.将C57BL/6小鼠分为4组:A组BCG皮内接种+喂硒、B组BCG皮内接种、C组单纯喂硒、D组对照组。免疫后观察小鼠饮水量和体重变化,于接种4周、8周后通过观察胸腺、脾指数及脾、肺的细菌数来评价BCG与有机硒联合应用的安全性及BCG的定植能力;通过检测淋巴细胞增殖指数SI、IL-2、IFN-γ、CTL杀伤活力、颗粒酶B及穿孔素的表达量来评价机体抗结核的细胞免疫能力。 3.使用Griess法、MTT法、Ziehl-heelson染色法及活菌计数法,通过检测各实验组小鼠腹腔巨噬细胞和巨噬细胞系Raw264.7细胞在不同硒浓度的培养液内感染BCG后的NO释放水平、细胞的存活率和载菌量来分析硒对巨噬细胞抗结核菌天然防御作用的影响。结果: 1. RT-PCR以及免疫组化结果显示,阳性细胞能稳定表达Ag85B。 2. BCG+Se组和BCG组小鼠饮水量、体重无显著性差别;BCG+Se组免疫4周、8周的脾指数、脾肺荷菌量和4周胸腺指数略高于BCG组,差异不显著;BCG+Se组的SI、IL-2、IFN-γ、CTL杀伤活力,免疫4周、8周后均显著高于BCG组,差异有显著性意义(P0.05。) 3.含硒感染孔的NO产量显著性高于无硒感染孔: BCG+ Se组以25ng/ml～100 ng/ml含硒孔NO增高显著(P0.05);含硒感染孔的Mφ成活率均高于无硒感染孔,P0.05;含硒孔荷菌量均低于无硒孔,但吞菌4h的活菌计数的结果却恰恰相反。结论: 1.含有Ag85B靶细胞的成功构建及应用,为评价结核疫苗的免疫效果提供了较好的研究手段。 2. BCG与有机硒联合使用并未有可见的毒副反应,安全可行;BCG与有机硒有免疫协同作用,能诱导机体产生较强的抗结核的细胞免疫应答。 3.有机硒对Mφ的抗结核天然防御免疫功能有促进作用,且有剂量依赖关系。同时,硒对巨噬细胞有应激保护作用。
【图文】：

示意图,真核表达质粒,示意图,双链环

0s及对照组的针对Ag85B的特异性CTL杀伤作：RT-PCR 试剂盒、限制性内切酶 EcoRⅠ、Hg85B 上游引物、下游引物（P1、P2）[1]由同赠。小鼠 actin 上游引物 P3：5′-GGGAAT GG P4：5′-AGA AGG AAG GCT GGA AAA GA pTB30s 由范雄林教授惠赠。由 5.4kb 双链环氨苄青霉素和新霉素抗性,图 1)与 880bpAg85B

内切核酸酶,质粒,验孔,效应细胞

比例（预实验 100：1、 25：1刺激的实验孔，，同时设靶细胞对束前 4h 加入 5mg/ml MTT10μ，A570 测定 A 值，计算杀伤率验孔 A 值－效应细胞对照孔为 2.605μg/μl，A260/A280 为图 2 所示：可观察到一条 880约 5.4kb 大小的条带，与第一泳1 2 M
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】