用噬菌体随机肽库筛选丙型肝炎病毒抗原表位

发布时间：2019-10-29 12:46

【摘要】：目的筛选噬菌体展示随机12 肽库中可以与HCV 抗体阳性的血清特异性结合的序列,在HCV 表达的蛋白分子上找到这个抗原表位, 分析其序列、结构特点与功能的关系。同时检验用阴性血清逆向筛选是否能提高筛选效率。从而探讨用噬菌体展示技术模拟HCV 抗原表位短肽,并用于对HCV 抗体检测的应用前景。方法1. 用饱和硫酸铵盐析法初提HCV 血清免疫球蛋白,再用DEAESehpadex A-50 进一步纯化。SDS-PAGE 鉴定纯化蛋白的纯度,ELISA 检测纯化蛋白的活性。2. 用纯化免疫球蛋白对噬菌体展示随机12 肽库进行3 轮亲和筛选并同时进行HCV 阴性血清逆向筛选。3. ELISA 方法检测各轮筛选的富集效果以及第三轮筛选后随机挑选的26 个噬菌体单克隆和HCV 阴性和阳性血清反应的特异性。4. Western blot 检测各阳性噬菌体单克隆展示多肽表位的类型以及筛选后所得噬菌体多克隆所展示多肽的抗原类型。5. 提取特异性噬菌体克隆单链DNA 并测定插入的外源序列。6. 利用生物信息学软件呈现噬菌体展示多肽的三维结构;分析表位多肽的抗原相关性质。结果1) 经过两步纯化后收集到免疫球蛋白的洗脱混合液,经SDS-PAGE电泳后未见杂带,达到电泳纯。纯化免疫球蛋白与HCV抗原ELISA反应结果为强阳性。2) 在第二轮筛选中经HCV阴性血清逆向筛选后的产出较对照明显偏低。对照孔产出/投入为5.0×10-5,经逆向吸收的筛选孔产出/投入为4.4×10-8。第三轮的产出/投入值较第二轮提高30多倍。3) ELISA检测发现在26个噬菌体单克隆中有5个克隆能与多份HCV阳性血清结合而不与阴性血清反应,显示较好的特异性(P0.05)。Western blot显示第三轮筛选收集的多克隆噬菌体中存在HCV线性表位。4) 经DNA测序发现5个克隆有2个克隆的DNA序列是完全相同的,即5个克隆包含了4种不同的抗原表位;同源性分析显示YFQVGLESIPRP 与HCV蛋白分子1082～1093位的氨基酸同源性较高,而MNALRPLSPWPT与1954～1965位氨基酸同源性较高。5)与筛选表位序列YFQVGLESIPRP相同或相似的氨基酸在蛋白三维结构上紧密相连,形成抗原应有的构象。两个表位在HCV蛋白上的同源区表现出较好的抗原性质。
【图文】：

免疫球蛋白,阳性血清

结果纯化及鉴定后的免疫球蛋白经过 DEAE Sephadex A50 层析看到一个明显的免疫球蛋白吸收峰（图 1），收混合作为备用靶分子。分光光度计检测浓度为 A-50 纯化的 HCV 阳性血清 IgG 达到电泳纯(图化的抗体为强阳性。

产出物,阳性血清,阴性,精确检验

LISA 结果轮筛选的产出物滴度测定平板（图 4）上随机挑取 26 个菌落分别阳性血清和 20 份阴性血清进行 ELISA 实验鉴定各克隆的特异性。表示如下(图 5、6、7、8，具体数据见表 2、3)。克隆 P2、P5、P6阳性血清反应的阳性率依次为 6/8、6/8、4/8、5/8、3/8，且均不与反应。用 SAS 统计学软件分析各克隆检测阳性血清和阴性血清的。由于样本含量较少，因此采用 Fisher 的精确检验，，结果显示克隆6、P13 的 p 均<0.01, 克隆 P25 的 p <0.05。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R392

【共引文献】