炭疽杆菌保护性抗原的克隆表达、纯化及鉴定

发布时间：2019-10-30 13:13

【摘要】： 目的:选择编码炭疽杆菌保护性抗原PA(protective antigen)的基因Pag,以炭疽杆菌A16R菌株为模板,克隆炭疽杆菌Pag基因,构建表达载体并在原核细胞中进行功能性表达,为炭疽杆菌亚单位疫苗的研制提供基础。 方法:参考Pet-32a载体序列多克隆位点,根据Pag基因序列设计引物,通过聚合酶链反应技术(PCR)获得目的片段,测序正确后构建到原核表达载体Pet-32a,构建载体命名Pet-32a-PA。转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,通过ELISA和Western-Blot等方法进行特异性鉴定。 结果:构建出Pet-32a-PA表达载体,经DNA序列分析和双酶切鉴定证实质粒构建正确,并均能在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达内表达。其表达形式为包涵体,经过变性、纯化、复性后通过ELISA和Western-Blot证实得到了具有活性的PA蛋白。 结论:成功构建出Pet-32a-PA表达载体,其蛋白表达产物经过复性后具有活性,为炭疽亚单位疫苗的研制提供了基础。
【图文】：

1.3 SDS-PAGE 鉴定 rPA 原核表达蛋白重组 pET32a/PA 质粒转化 BL21（DE3）表达菌，经过 IPTG和诱导前表达菌对照相比，表达菌经诱导后在 90kDa 左右有较量与预期一致。1.4 分析重组蛋白在大肠杆菌中的存在形式及 Western blot如图 2-3 PA 重组蛋白是以包涵体形式存在，表达菌超声后，Western blot 结果证明重组蛋白能够与小鼠抗 PA 单抗特异性图 2-1 PCR 鉴定重组质粒1：Marker DL30002：PCR product of pET32a/PA图 2-2 双酶切鉴定重组 pET32a/P1：Marker DL30002：pET32a/PA digested by Kpn

1.3 SDS-PAGE 鉴定 rPA 原核表达蛋白重组 pET32a/PA 质粒转化 BL21（DE3）表达菌，，经过 IPTG和诱导前表达菌对照相比，表达菌经诱导后在 90kDa 左右有较量与预期一致。1.4 分析重组蛋白在大肠杆菌中的存在形式及 Western blot如图 2-3 PA 重组蛋白是以包涵体形式存在，表达菌超声后，Western blot 结果证明重组蛋白能够与小鼠抗 PA 单抗特异性图 2-1 PCR 鉴定重组质粒1：Marker DL30002：PCR product of pET32a/PA图 2-2 双酶切鉴定重组 pET32a/P1：Marker DL30002：pET32a/PA digested by Kpn
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R392

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本文编号：2553829