抗肺炎衣原体OmpA基因VD2-VD3区重组蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

发布时间：2019-11-06 23:26

【摘要】： 将本室构建保存的含肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,Cpn)主要外膜蛋白(Maior Outer Membrane Protein,MOMP)优势表位(147～297aa)基因的重组表达体在大肠杆菌BL21中进行诱导表达，纯化表达产物并进行抗原性分析。应用杂交瘤技术，将SP2/0细胞与经重组Cpn MOMP_(VD2-VD3)免疫的雌性BALB/c小鼠脾细胞融合，筛选抗重组MOMP_(VD2-VD3)的单克隆抗体(Monoclonal Antibody,MAb)，并进行纯化和鉴定。用此MAb检测Cpn感染病人的标本，由此确定该MAb的应用价值，并为衣原体感染诊断的研究奠定基础。 方法：(1)使用镍亲和层析方法纯化重组MOMP_(VD2-VD3)。利用SDS-PAGE和Western-Blot分析和鉴定表达产物。(2)以纯化的重组MOMP_(VD2-VD3)免疫雌性BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合，用间接酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)筛选抗体阳性杂交瘤细胞。(3)收集接种过杂交瘤细胞的小鼠腹水，分别用间接ELISA法检测抗体效价、用MAb分型试剂盒鉴定MAb的类别、用微量荧光免疫试验(Microimmunofluorescence assay，MIF)检测MAb的特异性。(4)通过建立MIF检测Cpn感染病人和正常人外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，并进行统计学分析。 结果：重组目的基因表达菌在IPTG的诱导下，表达了相对分子量(Molecular weight,Mw)约为24KDa的目的蛋白，主要以包涵体形式存在；经Ni-NTA亲和层析纯化获得了纯度在95％以上的重组蛋白；Western-Blot检测其能与Anti-HisMAb发生特异性反应；应用纯化复性后的重组MOMP_(VD2-VD3)免疫雌性BALB/c小鼠，经过杂交瘤技术进行细胞融合；应用ELISA方法筛选了3株针对重组MOMP_(VD2-VD3)的MAb，分别命名为5D6、7G3、8C9；Western-Blot结果显示3株MAb与重组MOMP_(VD2-VD3)具有良好的免疫反应性；腹水诱生法大量制各MAb；间接ELISA检测3株杂交瘤诱生的腹水中MAb效价分别为1:51200、1:25600、1:25600；使用硫酸铵沉淀法对腹水中的MAb进行纯化；根据MAb亲和常数公式计算3株MAb亲和常数分别为52μg/mL、48μg/mL、47μg/mL；经Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit测定，3株MAb重链均为IgGl，轻链均为κ；对96例Cpn感染病人的PBMC进行MIF检测，自制MAb的Cpn感染检出率与临床Cpn IgG诊断试剂盒的检出率的复合率为96.9％。 结论： (1)制备了3株稳定分泌Cpn MAb的细胞株，经鉴定3种MAb均能识别重组MOMP_(VD2-VD3)，具有较好的特异性。 (2)获得Cpn MOMP_(VD2-VD3)MAb为IgG类。 (3)自制MAb的特异性和敏感性与商品化的Cpn IgG诊断试剂盒比较具有较好的一致性。
【图文】：

MOMPvoZ一vD3重组蛋白纯化的sDs~PAGE结果aoa行515ofpurioedMoMp粗z一卿~，bi.a，tp，CedPET3O，MOMPvDZ一vD3;2.Celllysate;3.FIOwthr200mM);5.Eluates(咪哇浓度:250血M);6.Pr性分析为一抗，，研陌stem一Blot分析MOMPvDZ一vD3重和纯化蛋白在同一位置出现了单一特异性条带，见图2o123…争_气一侍气{一J一J_砂犷飞‘一诱内砚泌重组蛋白MOMP切z~的M触，ternblot分析
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R374

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

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2 刘广超;吴移谋;;肺炎嗜衣原体诊断方法的研究进展[J];微生物学免疫学进展;2006年04期

3 刘钢,胡翼云,赵德环,李红莉,王树欣,江载芳,杨永弘;巢式聚合酶链反应诊断肺炎衣原体感染的临床应用探讨[J];中华微生物学和免疫学杂志;2001年04期

本文编号：2556976