人嗜酸粒细胞亲合素（Eotaxin）系列N端突变体及其原核表达载体的构建及表达

发布时间：2019-11-09 13:21

【摘要】： 背景: 嗜酸粒细胞在变应性炎症局部募集和活化、以及嗜酸粒细胞释放的炎症介质的作用导致了变应性鼻炎发生。嗜酸粒细胞在炎症局部的募集是由趋化因子介导。Eotaxin是作用最强的嗜酸粒细胞趋化因子,其通过与表达于嗜酸粒细胞表面的惟一受体CCR3结合而发挥生物学作用。研究已表明采用抗CCR3抗体等阻断CCR3-Eotaxin轴的作用可缓解变应性疾病。对野生型Eotaxin结构和功能相关性的研究显示Eotaxin N氨基末端在其与受体结合后的信号传导中起重要作用。突变其N氨基末端将极大地改变Eotaxin的生物学活性,并可望获得具有与CCR3结合能力而不能引起相应信号传导的CCR3拮抗剂。理论上,由于CCR3是Eotaxin的惟一受体,Eotaxin突变体拮抗CCR3的作用强、特异性高。 目的: 本实验拟通过基因操作技术,获得人嗜酸粒细胞亲合素Eotaxin基因,构建系列的Eotaxin N端突变体及其原核表达载体,为进一步纯化和检测其生物学活性,筛选CCR3拮抗剂做准备。 方法: 1、从脾脏提取总RNA,经RT-PCR扩增编码人Eotaxin全长cDNA序列,然后将目的片段克隆至T载体(pTZ57R),得到重组质粒PT-Eotaxin,重组质粒用Eotaxin特异性引物进行PCR鉴定,并用内切酶KpnⅠ,XhoⅠ进行双酶切鉴定,最后送上海博亚生物技术有限公司进行序列分析。 2、根据PT-Eotaxin的序列,使用突变引物设计软件,针对Eotaxin成熟链N末端设计8对特异性点突变引物,用点突变的方法,在PT-Eotaxin的基础上用Met替代(单个)Eotaxin N-端肽氨基酸残基,突变PCR产物转入大肠杆菌XLl-Blue后用氨苄青霉素筛选,获得突变体重组子(Met-Eotaxins),选取阳性克隆进行序列分析。 3、根据突变体重组子-Met-Eotaxins成熟链部分序列,自行设计5对特异性引物,扩增野生型及各突变体的成熟链片段,使用定向克隆技术将目的片段克隆到原核表达载体pET30a(+)上,重组子用卡那霉素进行筛选,阳性克隆提取质粒后用T7引物做PCR鉴定,内切酶KpnⅠ,XhoⅠ进行双酶切鉴定,最后进行序列测定,获得重组表达质粒(pET30a(+)-Eotaxin,pET30a(+)-Met-Eotaxins)。 4、将鉴定正确的9个重组质粒分别转化表达型宿主菌Ecoli BL21(DE3),经筛选后即得特异性表达Eotaxin和Met-Eotaxins成熟链融合蛋白的工程菌。将单克隆工程菌接种到50ml含有卡那霉素的LB培养液中,37℃摇菌培养到对数中期(OD600=0.5～1.0),加入IPTG继续诱导培养1～6h,收集菌体。对诱导产物分别进行SDS-PAGE和Western-Blot分析。 结果: 1.重组质粒PT-Eotaxin,用Eotaxin特异性引物进行PCR鉴定,以及用内切酶KpnⅠ,XhoⅠ进行双酶切鉴定,PCR扩增片段与酶切片段实际大小均与理论大小一致;序列分析结果与genbank对照,完全符合。 2.突变体重组子(Met-Eotaxins)序列分析结果经对照发现,我们得到的突变体与设计完全一致。 3.重组表达质粒(pET30a(+)-Eotaxin,pET30a(+)-Met-Eotaxins)用特异性引物(T7)进行PCR鉴定,以及用内切酶KpnⅠ,XhoⅠ进行双酶切鉴定,PCR扩增片段与酶切片段实际大小均与理论大小一致,序列分析结果表明,各重组表达质粒中,Eotaxin与Met-Eotaxins的核苷酸序列完全正确,读码框无移位。 4.重组表达质粒诱导产物SDS-PAGE分析结果表明,各重组表达质粒诱导表达产物中均有相应的融合蛋白表达,而且各重组融合蛋白表达水平较高,表达量可达总蛋白量的32～35.5%。进一步Western-Blot分析表明,各融合蛋白均能和特异性Eotaxin一抗结合,证实所表达的确系目的蛋白。 结论: 本实验成功克隆了Eotaxin基因,成功的构建了一系列EotaxinN末端的突变体重组子(Met-Eotaxins),并成功的构建了Eotaxin及其一系列N末端的突变体成熟链的重组原核表达质粒(pET30a(+)-Eotaxin,pET30a(+)-Met-Eotaxins),各重组融合蛋白获得了正确的表达。系列Eotaxin N端突变体和其原核表达载体的成功构建和诱导表达,为进一步纯化出相应蛋白,并筛选出CCR3拮抗剂奠定了良好的基础。
【图文】：

PCR扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果，M为marker(DL2O00)，l、2、3泳道为选取的3个阳性重组子的PCR产物

3.重组表达质粒(pET3Oa(+)一Eotaxin，，pE丁3oa(+)一Mer一Eotaxins)的鉴定3.1用特异性引物(T7)进行PCR鉴定，以及用内切酶Kpnl，xhol进行双酶切鉴定，PCR扩增片段与酶切片段实际大小均与理论大小一致。(图4一6)图4重组表达质粒pET3oa(+)一Eotaxin的peR及酶切产物1.5%琼脂糖凝胶电泳结果，MI为Marke:I，MZ为Marker八，l、3、5、7泳道为选取的4个阳性重组子的PCR产物，2、4、6、8泳道为选取的4个阳性重组子的酶切产物。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R765.21;R346

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本文编号：2558466