HIV-Tat-CLIO标记对大鼠骨髓间充质干细胞生物学行为的影响及MRI示踪效果研究

发布时间：2019-11-16 05:32

【摘要】： 第一部分HIV-Tat-CLIO标记对大鼠骨髓间充质干细胞生物学行为的影响目的：探讨HIV-Tat蛋白转导域交联氧化铁复合物(HIV transduction domaincross-linked iron oxide,HIV-Tat-CLIO)标记对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(rat marrow-derived mesenchymal stem cells,rMSCs)的可行性、剂量关系以及对细胞活力、增殖、分化和迁移能力等生物学行为的影响。材料与方法：原代培养rMSCs至第3代，检测CD34，CD45和CD90的表达以鉴定之。不同浓度的HIV-Tat-CLIO标记rMSCs后利用普鲁士铁染色、体外MRI显像及台盼兰细胞活性测定等方法确定最佳标记条件。用CLIO 25μg／ml和HIV-Tat-CLIO 25μg／ml分别标记rMSCs各24h，通过普鲁士兰铁染色比较两组纳米铁的细胞标记效率。运用普鲁士兰染色及扫描电镜技术观察铁颗粒的细胞内存在部位。MTT实验测定该标记方法对细胞增殖能力的影响；流式细胞仪测定标记前后细胞表面标记物的表达及细胞周期的变化；通过油红0和碱性磷酸酶染色测定这种标记方法对rMSCs细胞分化能力的影响；Transwell实验测定其对干细胞迁移能力的变化。结果：培养的第3代rMSCs CD34(-)，CD45(-)和CD90(+)。HIV-Tat-CLIO最佳标记浓度为25μg／ml。HIV-Tat-CLIO组较CLIO组在rMSCs的标记效率上获得明显改善。细胞标记后，A570波长的光吸收值无明显变化；细胞表面CD34、CD45和CD90分子的表达无明显差异；处于S期的MSCs数量(S％)、G_1％、增殖指数PrI值(S+G_2M)％以及细胞凋亡情况均无显著改变；这种标记物对细胞分化和运动迁移能力均无显著影响。结论： HIV-Tat-CLIO标记大鼠MSCs后对其生物学行为无明显影响，标记后的干细胞可以正常增殖、分化及运动迁移，为磁共振活体监测干细胞移植后的动态变化提供有力的保证。第二部分干细胞移植治疗大鼠后肢缺血中HIV-Tat-CLIO标记磁共振体内示踪的研究目的：探讨磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)无创体内示踪HIV-Tat-CLIO(HIV transduction domain cross-linked iron oxide)标记的移植大鼠骨髓间充质干细胞(rat Marrow-derived Mesenchymal Stem cells,rMSCs)的可行性和有效性，并且对该标记后的rMSCs移植治疗大鼠后肢缺血的效果进行客观评价。材料和方法：原代培养6周龄雄性SD大鼠的rMSCs至第3代，检测CD34，CD45和CD90的表达以鉴定。用HIV-Tat-CLIO 25μg／ml标记rMSCs 24h。另有一组细胞继续以5-溴脱氧尿苷(BrdU)3μg／ml复合标记rMSCs 24h。于大鼠右后肢缺血模型建立后的第7天进行rMSCs细胞移植。选用6周龄雄性SD大鼠28只，分为4组，，每组各7只。A组为移植HIV-Tat-CLIO标记的rMSCs；B组为移植HIV-Tat-CLIO及BrdU复合标记的rMSCs；C组为移植未标记的rMSCs；D组为注射同移植体积的无菌PBS液。分别在移植术后3d、1周、2周、4周进行MRI检查示踪HIV-Tat-CLIO标记的rMSCs分布情况(C组和D组仅于术后第3d进行MRI扫描1次)。在第4周各组均采用非致冷红外热成像仪检测大鼠后肢皮肤温度，进行缺血后肢的损伤评分，并进行DSA造影，之后处死所有大鼠进行组织学检查。进行HE染色和普鲁士兰铁染色，BrdU、Ⅷ因子免疫组化染色，并计算毛细血管密度。结果培养的第3代rMSCs CD34(-)，CD45(-)和CD90(+)。B组和C组各有1只实验鼠因切口感染坏死，分别于术后第5天和第8天死亡，B组另有1只于移植术后第2周MRI检查时麻醉意外死亡。其余25只均存活至术后第4周。MRI检查：A组和B组在MRI上的显示接近。C组和D组在MRI上无特殊信号变化。A组和B组在术后第3d，MRI显示注射部位圆形低强度信号影；术后1周，MRI显示原低信号灶呈中心向周围扩散趋势，信号呈颗粒状，部位与随后的组织学检查结果一致；术后第2周见低密度影进一步扩散，信号强度有所弱化；术后第4周信号强度进一步弱化。低密度颗粒扩散范围局限于原部位7mm处。非致冷红外热成像仪检测大鼠后肢皮肤温度发现：A、B、C和D组的右后肢平均皮肤温度分别为32.12±0.51℃、32.39±0.61℃，31.97±0.56℃、31.16±0.67℃。A、B、C这3组间平均皮肤温度无显著性差异(P＞0.05)，A组与D组，B组与D组，C组与D组间均有显著性差异(P＜0.05)。缺血后肢的损伤评分：A、B、C和D组的缺血后肢损伤评分分别为0.68±0.17、0.65±0.24、0.67±0.11、1.79±0.22。A、B、C这3组间缺血后肢损伤评分无显著性差异(P＞0.05)，A组与D组，B组与D组，C组与D组间均有显著性差异(P＜0.05)。DSA造影：A、B、C和D组的造影显示大鼠缺血侧后肢大腿部从股骨大转子至股骨下段区域内的血管评分平均各为：2.56±0.37、2.51±0.29、2.58±0.26、1.33±0.41。A、B、C这3组间缺血后肢DSA造影血管评分无显著性差异(P＞0.05)，A组与D组，B组与D组，C组与D组间均有显著性差异(P＜0.05)。组织学检查：A、B、C和D组的缺血后肢肌肉组织中毛细血管密度分别为570.35±68.17／mm~2、563.02±61.26／mm~2、576.97±77.87／mm~2、513.01±70.68／mm~2。A、B、C这3组间毛细血管密度无显著性差异(P＞0.05)，A组与D组，B组与D组，C组与D组间均有显著性差异(P＜0.05)。BrdU染色、普鲁士铁染色、Ⅷ因子免疫荧光及MRI的结果有良好的相关性。结论 HIV-Tat-CLIO标记的rMSCs移植入大鼠后肢缺血模型后可以运用MRI进行动态监测，根据低强度信号的范围变化可以比较清晰的显示移植后的rMSCs在宿主体内的迁移和分布。rMSCs移植能够提高大鼠后肢缺血组织的血管再生能力，促进缺血肢体的血运重建和功能恢复，而HIV-Tat-CLIO标记并不影响rMSCs的治疗作用。
【图文】：

成纤维样细胞,漩涡,相差显微镜,形态

1.培养的rMsCS形态学观察倒置显微镜下可见细胞呈现较强的贴壁生长特性，形态上呈纺锤形的成纤维细胞状并呈有序的漩涡状排列(图2)。图2:第3代rMscs为成纤维样细胞形态呈有序的漩涡状排列，倒置相差显微镜 (X100)。2.培养的rMSCS经流式细胞仪鉴定第3代rMSCS的细胞表面CD34阴性表达，CD45I泪性表达，CDgO阳性表达。符合干细胞表面特异性标记物的表达(图3)。一业些塑些匕一If\L止竺竺一」泛竺丛匕兰竺些巴若甲义‘___一’田钾0夺瑞r书护丁荒，p一4洲白曲1州日Zh.妒.心阅5伽贪饰篇概。’o1“r‘一劝:.，.0.期吕，:，一;

流式细胞仪,日奈,性表达,干细胞

2.培养的rMSCS经流式细胞仪鉴定第3代rMSCS的细胞表面CD34阴性表达，CD45I泪性表达，CDgO阳性表达。符合干细胞表面特异性标记物的表达(图3)。一业些塑些匕一If\L止竺竺一」泛竺丛匕兰竺些巴若甲义‘___一’田钾0夺瑞r书护丁荒，p一4洲白曲1州日Zh.妒.心阅5伽贪饰篇概。’o1“r‘一劝:.，.0.期吕，:，一;，。一，一。论月11闪刀O口p.目h一It力00 !!!:::lll尸尸火、、r毛毛一:公二y一卜0众拍M日幽.1%心Jted，一一峋-一一月任Ico刀幻po以枷一肠刀叼吕N容月吕一0O一吕CD洲卜l代B功幼节目U.的7C卜心F欣8日奈Z卜的，自冈以)5毓目公 IOD1502阅Z乏D向阳臼d枷目田图3:第3代rMSCs经流式细胞仪鉴定CD34卜)
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R329

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