葡萄糖调控新基因GMRP-1与NCEx的表达及初步功能研究

发布时间：2019-11-21 03:48

【摘要】：第一部分 人糖代谢相关蛋白-1的蛋白表达与功能的初步研究 目的 克隆和表达人糖代谢相关蛋白-1(GMRP-1)基因，初步揭示GMRP-1的功能。 方法 RT-PCR克隆GMRP-1基因全长，，将GMRP-1基因构建到原核表达载体pET-32a与真核表达载体pEGFP—C3，在E.col ROSSET(DE3)菌中高效表达并纯化GMRP-1融合蛋白，免疫新西兰兔，制备多克隆抗体；利用共聚焦显微镜观察GMRP-1在HEK293细胞中的定位。利用Northern Blot与Western Blot技术观察了GMRP-1基因和蛋白表达谱，利用双重免疫荧光组化和激光扫描共聚焦显微镜观察GMRP-1在胰腺中的定位。同时利用Northern Blot与Western Blot技术观察不同浓度葡萄糖不同作用时间对β-TC3细胞GMRP-1的基因和蛋白表达的影响。通过转染和RNA干扰技术观察GMRP-1与β-TC3细胞胰岛素分泌的关系。结果 成功制备特异性好、效价较高的多克隆抗体。激光共聚焦显微镜显示GMRP-1定位于HEK293细胞的细胞浆中。GMRP-1表达广泛，其中在脑、骨骼肌、脂肪、肝脏、主动脉、十二指肠及β细胞株β-TC3中表达较高。双重免疫荧光组化和激光扫描共聚焦显微镜显示GMRP-1定位在胰岛中，在胰腺的外分泌腺中没有表达，同时GMRP-1与胰岛素有部分的重叠。葡萄糖对β-TC3细胞GMRP-1表达的影响呈剂量和时间依赖性关系，葡萄糖浓度增加，GMRP-1表达增加，20mmol／L浓度下表达最高。葡萄糖作用时间增加，GMRP-1表达增加，72小时表达最高。β-TC3细胞过表达GMRP-1及RNA干扰技术沉默β-TC3细胞GMRP-1表达后，胰岛素分泌没有明显的差异。结论 GMRP-1特异性定位于大鼠胰岛中，葡萄糖可以调控它在胰岛β细胞中的表达，它在高糖导致的胰岛β细胞功能变化中发挥重要的作用，它与β细胞胰岛素分泌之间没有直接的关系。 第二部分 人新型钠钙交换蛋白NCEx的蛋白表达与功能的初步研究 目的 克隆和表达人新型钠钙交换蛋白NCEx基因，初步揭示NCEx与糖尿病大血管并发症的关系。方法 RT-PCR克隆NCEX基因全长；将NCEX基因构建到绿色荧光真核表达载体pEGFP—C3，利用共聚焦显微镜观察NCEX在HEK293细胞与小鼠胰岛素瘤β-TC3细胞中的定位。荧光分光光度仪观察细胞内钙离子浓度变化。Western印迹检测NCEx在高血糖猴各组织与2型糖尿病主动脉组织NCEX蛋白的差异表达，RT-PCR检测NCEX基因在人主动脉平滑肌细胞(HASMC)、人主动脉内皮细胞(HAEC)和人血管巨噬细胞(THP-1)细胞中的表达及不同葡萄糖浓度对其基因表达的影响，Northern blotting杂交验证高糖作用HAEC细胞NCEX mRNA的表达差异。结果 重组载体pGFP-C3—NCEX转染后，定位于HEK293细胞与β-TC3细胞的细胞膜上。荧光分光光度仪观察到NCEx过表达后HEK293细胞内游离Ca2+浓度明显高于正常对照组，并有显著统计学差异。当细胞外145 mmol／L的Na~+完全由145mmol／L的Li~+置换后，NCEx过表达的HEK293细胞内Ca2+浓度出现大幅度的升高，在测定过程中加入终浓度为5mmol／L KCl时，对细胞内游离Ca2+浓度变化没有影响。同时发现NCEx蛋白在高血糖猴与糖尿病患者主动脉中表达上调，而在其他组织中无差异表达。同时发现NCEx主要表达在HAEC中，而HASMC和THP-1表达量低，RT-PCR和Northern Blotting结果显示NCEx基因在血管内皮细胞的表达受到血糖的调控，作用72小时后，随着D-葡萄糖浓度的升高，NCEx基因表达逐渐增加。结论NCEx的双向转运模式主要以逆向转运模式即将细胞外Ca2+转运入细胞内为主。NCEx在糖尿病大血管并发症中发挥重要的作用。
【图文】：

复旦大学博士研究生毕业论文已经得到表达量较高的GMRP一1融合蛋白(见图1一5)。同时通过超声粉碎菌体后取上清和沉淀行SDS一PAGE电泳，显示目的蛋白在沉淀即包涵体中表达，而上清中无表达(见图1一6)。 234 234”6目~撇咤翻日，一，鹭娜嵘肇一

本文编号：2563819