可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白的辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备

发布时间：2019-11-29 19:05

【摘要】： 目的人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus，RSV)广泛流行于世界各地，是婴幼儿下呼吸道感染的最重要病原。目前尚无安全、有效的疫苗用于预防RSV感染。RSV两个重要的糖蛋白膜表面表达的融合蛋白F(fusion protein，F)和粘附蛋白G，是激发机体产生中和抗体的主要蛋白，也是疫苗研究发展的重要内容。与G蛋白相比，F蛋白有更多的抗原识别位点，不同亚型间F蛋白高度保守、同源性高达86％，能刺激机体产生体液免疫及细胞免疫应答，针对F的中和抗体具有交叉保护作用，，是RSV疫苗研究的最重要的靶抗原。辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector，HDAd)主要用于基因治疗研究，作为疫苗载体的研究起步较晚，尚没有作为黏膜基因释放系统用于疫苗研究的报道。HDAd与腺病毒具有相同的细胞嗜性，对呼吸道上皮细胞具有高效感染的能力，且能长期、持续表达转基因，具有重要的研究与使用价值。本研究拟构建可表达A亚型RSV F蛋白的辅助病毒依赖型腺病毒载体(HDAd／F)，并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定，为进一步的体内免疫效果和免疫保护作用研究奠定基础。 方法将带有CMV启动子序列的F基因亚克隆至克隆载体pSC11，鉴定正确后，克隆至HDAd质粒pSC15B，构建pSC15B／F HDAd重组质粒，PmeⅠ消化pSC15B／F去除原核复制元件及抗性基因，获得HDAd／F DNA分子，经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞，16 h后感染辅助病毒，收获HDAd／F载体粗提液，随后以HDAd／F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd／F达到复制极限，同时以可表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，LacZ)报告基因的HDAdLacZ载体作为平行对照监测载体复制过程。大量制备HDAd／F，CsCl密度梯度及等密度梯度两次超速离心纯化，利用分子生物学技术体外鉴定HDAd／F表达情况。 结果成功构建了可表达RSV F蛋白的HDAd／F载体，通过与辅助病毒共感染293Cre4细胞及CsCl梯度法超速离心制备了大量纯化的HDAd／F载体，透射电镜观察显示HDAd的直径约为70 nm，具有典型的腺病毒形态，运用分光光度测定法分析表明纯化后HDAd载体颗粒浓度为：7.4×10~(12)(vp／ml)，体外感染293细胞，RT-PCR检测到F基因有转录，Western blot分析表明F蛋白有特异性表达。 结论成功构建HDAd／F载体并在真核细胞中实现表达，为体内免疫学效力试验奠定基础，为研制RSV疫苗提供了一种新方法。
【图文】：

图3制备HDA出F载体的Cre几oxP系统示意图Fig3TheCre几oxPsystemforgeneratingHDAd/Fveetors留约4ml，用吸管重悬沉淀，置于一80℃冰箱，30min，取出病毒置于室温或37℃

在显影液中显影Zmin左右;定影10min至胶片透明;片10min，然后晾干保存。Cll邝A3.1(+)/F重组质粒本实验室已法鉴定，在此基础上使用限制性和pSCH，回收目的片段，将含连接，转化、挑菌和摇菌，然后显示，得到一条约2100bp的电
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R346

【参考文献】

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本文编号：2567576