CT基因PRTD-NY2的功能研究

发布时间：2019-12-02 16:09

【摘要】： 精子发生和肿瘤之间存在许多相似性，其中一个重要的标志就是数量不断增加的肿瘤／睾丸(Cancer／testis，CT)基因的发现。发现并研究CT基因的功能，有利于对精子发生和肿瘤机制的阐明。 PRTD-NY2是本实验室在成人睾丸中克隆出的一条新基因，生物信息学提示它是一个F／RL家族的RGS蛋白，并且该基因的染色体定位区域与肿瘤的发生密切相关。本研究中，我们对PRTD-NY2基因在精子发生和肿瘤发生过程中的作用及其机制进行了探讨。 首先我们通过RT-PCR发现PRTD-NY2为CT基因。人睾丸组织免疫组化，显示PRTD-NY2蛋白细胞定位在生精上皮的精原细胞和精母细胞细胞浆以及精子细胞的细胞浆和细胞核中表达；精子免疫荧光提示PRTD-NY2定位于核后区的胞浆和胞质残余体中；RT-PCR显示PRTD-NY2在成人睾丸高表达；在唯支持细胞综合症患者中不表达；在生精阻滞于精子细胞前的病人中几无表达，从而提示PRTD-NY2可能主要在精子细胞及以后的精子发生中发挥作用。 RGS蛋白可以直接与激活的Gα亚基结合来负调节G蛋白信号，即失活Gα亚基并降低G蛋白偶联受体(GPCR)信号，为负调控因子。因此进一步我们通过Pull down和免疫共沉淀证实在睾丸中PRTD-NY2能和G蛋白α亚基12、13及q相互作用。PRTD-NY2作为RGS蛋白，其在睾丸中的作用通过抑制G蛋白α亚基12、13及q通路而体现。 因此，我们对Gα12在精子发生中的作用进行了研究。发现Gα12蛋白表达在Leydig细胞以及Sb期开始变形的精子细胞以后的各级生精细胞的细胞浆中，在精子中主要定位于颈部中心粒以及中段。通过正常睾丸和精子中F-actin以及α-tubulin与Gα12的共定位研究，提示Gα12可能参与了F-actin和α-tubulin介导的为精子细胞极性和尾部形成而产生的细胞骨架重组。非阻塞型无精症患者睾丸中Gα12的表达缺陷可能是导致精子发生障碍的原因之一。低活力的精子中Gα12表达异常，并且Gα12的表达异常主要在中段卷曲的精子中发生，，提示在精子变形前两个阶段Gα12产生异常或部位改变，和／或最后阶段的保留异常可能是导致精子活力低下的原因。PRTD-NY2在精子细胞浆中有表达，并且与Gα12相作用，可能协同参与了精子变形过程中细胞极性和尾部形成相关的细胞骨架重组。 接着，我们又对Gα13在精子发生中的功能进行了研究，发现人睾丸和精子均有Gα13的表达，并且小鼠睾丸及精子中Gα13的表达片段大小与体组织中一致。免疫组化发现在人和小鼠睾丸中Gα13表达于精原细胞和精母细胞的胞浆而在延伸的精子细胞的细胞核；小鼠各级生精细胞的免疫荧光也观察到Gα13从圆形精子细胞浆随着精子变形转运入核；人精子免疫荧光检测证实Gα13表达于细胞核。这些均与Gα13在体组织中的亚细胞定位不同。Gα13在不育患者的大头精子中表达异常，这提示Gα13与精子核的正确变形相关。通过PRTD-NY2的睾丸免疫组化和PRTD-NY2片段的亚细胞定位研究，我们发现其定位与Gα13高度一致，且其N端具有核定位信号，提示在核变形的过程中，睾丸特异的PRTD-NY2可以协同Gα13从胞浆转运至胞核，从而参与了核浓缩。 最后我们对PRTD-NY2基因在肿瘤发生过程中的功能及机制进行探讨。96例人肿瘤组织芯片分析，发现PRTD-NY2蛋白表达于上皮来源的肿瘤(主要是鳞状细胞癌和腺癌)中。多种鳞癌及腺癌肿瘤组织及食道癌组织芯片的免疫组织化学、不同迁移能力的肿瘤细胞系的RT-PCR和Western Blot、超表达及RNAi PRTD-NY2的肿瘤细胞在裸鼠体内所致的肿瘤转移实验均提示PRTD-NY2与肿瘤的转移相关，其具有抑制肿瘤转移的作用。 PRTD-NY2在大肠杆菌和多种肿瘤细胞中均可通过不同的翻译起始位点翻译为不同片段大小的蛋白。PRTD-NY2在肿瘤细胞中可表达146KD片段和76KD片段，能抑制肿瘤细胞在裸鼠腹腔内的种植转移和向远处器官肺脏的转移。PRTD-NY2对肿瘤细胞的粘附力无影响，划痕实验和transwell实验均证实PRTD-NY2能降低肿瘤细胞在LPA刺激下的迁移。肿瘤细胞的pull down和LPA刺激的细胞变形实验证实：PRTD-NY2是通过与Gα12／13相作用，抑制LPA刺激的Gα12／13介导的F-actin的形成。划痕实验和transwell实验还发现仅有76KD片段大小的PRTD-NY2表达也可显著抑制肿瘤细胞在LPA刺激下的迁移，提示76KD的片段可能是PRTD-NY2抑制肿瘤转移的主要形式。 综上所述，PRTD-NY2是一个新CT基因，在睾丸中它能与Gα12、Gα13以及Gαq相互作用，通过协同Gα12参与了精子变形中细胞极性和尾部的形成，并能通过其核定位信号协助Gα13在精子变形过程中从细胞浆转运至细胞核，从而参与了核浓缩过程。在原核和真核细胞中，PRTD-NY2均可通过不同的翻译起始位点翻译为不同片段大小的蛋白。它是通过与Gα12／13相作用，抑制LPA刺激的Gα12／13介导的F-actin的形成，抑制肿瘤细胞迁移和肿瘤转移。
【图文】：

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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R346;R73-3

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