自体骨髓间充质干细胞经皮注射修复骨缺损的实验研究

发布时间：2020-01-23 16:25

【摘要】： 目的：建立兔骨髓间充质千细胞(Bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)的体外培养和成骨诱导体系。对BMSCs的抽取方式进行改良，评价BMSCs体外传代培养时不同培养基对BMSCs增殖能力的影响。比较自体BMSCs、成骨诱导后的BMSCs及二者联合经皮移植后体内成骨能力的差异，评价其经皮注射修复小段骨缺损的疗效，为骨组织工程选择种子细胞提供依据，为临床上治疗小段骨缺损以及骨不连提供一个新的思路。方法：1．抽取日本大耳白兔骨髓，用全骨髓培养法进行BMSCs的体外培养、扩增。取第2代BMSCs进行成骨诱导。定量测定培养液上清ALP活性，找出最强成骨活性的时间窗，并对成骨诱导前后的细胞增殖能力、成骨活性等生物学特性进行比较。 2．随机将16只日本大耳白兔32侧髂部分为4组，前3组用骨穿针取骨髓，，第4组用普通一次性20毫升加药注射器抽取骨髓，分别用α-MEM、DMEF-12、DMEM、DMEM行全骨髓培养法制备BMSCs。比较4组细胞长满培养瓶所需天数及第2代BMSCs生长曲线。 3．制作新西兰大白兔桡骨中段15mm骨缺损模型，20只兔共40侧骨缺损模型随机分为5组，每组8侧。A组经皮植入自体1×10~6个BMSCs和1×10~6个己向成骨细胞诱导的BMSCs，B组植入2×10~6个已向成骨细胞诱导的BMSCs，C组植入2×10~6个BMSCs，D组植入纤维蛋白胶复合5mgBMP，E组为空白对照组。术后对动物进行大体观察、摄X线片观察各组不同时相骨缺损修复情况，比较不同时相的骨缺损区X线阻射密度、并于术后第4，8，12周取出骨缺损区标本进行大体观察和组织学切片观察；取第12周标本进行生物力学检测。结果：1．骨髓穿刺针与普通一次性20毫升加药注射器所取骨髓经全骨髓培养法获得的BMSCs的数量及细胞形态、生长曲线没有统计学差异。 2．α-MEM培养基比DMEM、DMEF-12行全骨髓培养法制备BMSCs所需时间大大缩短，加入骨诱导成分后成骨诱导效率更高。 3．BMSCs与成骨诱导后的BMSCs联合移植组在12周内骨缺损区新生骨的数量和质量显著优于单纯移植BMSCs或单纯移植成骨诱导后的BMSCs，空白组骨缺损主要由纤维结缔组织填充。X线显示术后4周即可发现4组动物的桡骨缺损区域均有明显骨痂生成，第12周时A组即细胞联合移植组的骨缺损完全愈合，各时相局部X线阻射密度值显示，A、D组的新生骨痂最多，且可见髓腔再通现象；生物力学检测显示A组桡骨标本的四点弯曲断裂载荷均显著高于其余2实验组。结论：普通一次性20毫升加药注射器可代替骨穿针抽取兔髂嵴部位骨髓；α-MEM培养基比DMEM、DMEF-12更适合兔BMSCs的培养及成骨方向的诱导；.BMSCs与成骨诱导后的BMSCs联合移植具有更强的成骨能力，可作为种子细胞应用于骨组织工程。
【图文】：

骨髓,造血干细胞,脂肪滴,方向诱导

3.6BMSCs脂肪方向诱导14天取出细胞爬片行油红O染色，见多数细胞胞浆内有呈橙红色的小圆形脂肪滴，部分细胞内的脂肪滴把胞核挤到了一侧(见附图1一Zd)。讨论骨髓内有两种干细胞:造血干细胞和间充质干细胞。临床上出于骨髓移植的需要，对造血干细胞的研究比较深入。造血干细胞能分化成全系列的血液细胞，但无法分化成结缔组织的细胞。早在十九世纪六十年代就已发现骨髓的成骨特性。自20世纪70年代 Friedenstein等发现骨髓标木中有少量贴附细胞在培养过程中能分化形成类似骨、软骨的集落后，对骨髓中这一小部分贴壁细胞的研究日渐深入。随后的研究证实，骨髓成骨特性的基础在于骨髓内的这种成骨性前体细胞。大量文献报道了从不同种属如鼠、兔、犬、人

生长曲线,培养条件,生长曲线,处理组

图2一3不同培养条件下BMSCS的生长曲线3.3成骨诱导后的BMSCS培养上清液ALP的活性测定结果见表2一3，图2一4。第3天时a一MEM组与另2处理组无统计学差异 (P>0.05)，第6天Q一MEM组与DMEF一12组无统计学差异 (P>0.05)，但与DMEM组有差异(P<0.05)，从第9天起Q一MEM组与另3组有显著统计学差异(P<0.01)。3个处理组与未诱导对照组全程均有显著统计学差异(p<0.01)。表2一3成骨诱导后的BMSCS培养上清液ALP的活性测定Q一证M组D能F一12组DMEM组未诱导组第3天15士714士510士6第6天31士723士1221士10第9天49士835士932士511士5第12天62士1345士942士11第巧天53士1437士66士49士614士435士1117士7
【学位授予单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R329;R687.3

【参考文献】