发夹型荧光分子探针用于DNA甲基化酶的研究

发布时间：2020-01-24 18:32

【摘要】： DNA甲基化是DNA与甲基化酶相互作用的结果,是DNA分子重要的碱基修饰方式之一,它可以影响到核酸的结构以及与蛋白质的相互作用等,进而影响到基因表达和肿瘤的发生发展,因而是一个引起广泛兴趣的研究领域。本论文利用荧光分子探针设计简便、灵活的特点,着眼于研究DNA与甲基化酶相互作用,开展的工作主要包括以下三个方面: 1.发夹型荧光分子探针用于DNA甲基化酶的活性分析及其在药物筛选中的应用设计了茎部较长的发夹型荧光分子探针,该探针比传统的分子信标荧光探针具有更高的稳定性,甲基化酶和相应的限制性内切酶的识别位点被设计在发夹型探针的茎部,荧光基团被连接在探针的5'端,其荧光被连在3'端的熄灭基团所熄灭。限制性内切酶可切割未发生甲基化修饰的探针,导致探针的发夹结构遭到破坏,引起荧光基团荧光信号的恢复。根据荧光信号的恢复程度可实现对甲基化酶活性的分析。在此基础上,建立了一种简便、快速分析抗肿瘤药物对DNA甲基化酶活性的影响的方法,为筛选针对基因甲基化异常引起的恶性肿瘤的治疗药物提供了一种新的思路和方法。 2.发夹型荧光分子探针用于实时监测Taq I甲基化酶对DNA的甲基化利用发夹型荧光分子探针设计的灵活性,根据Taq I甲基化酶和Dpn I限制性内切酶识别序列关系,在分子探针的茎部设计了两个相邻的Taq I甲基化酶的识别位点,当探针茎部两个识别位点被Taq I甲基化酶修饰时可形成限制性内切酶Dpn I的切割位点,发夹结构的茎部被Dpn I切割而释放荧光信号,实现了实时监测Taq I甲基化酶对分子探针的甲基化过程,根据切割反应的初始速率实现了Taq I甲基化酶活性的分析,该分析过程非常简便、快速。 3.酶识别序列外DNA甲基化对酶与DNA相互作用的影响合成了酶识别序列外的胞嘧啶或腺嘌呤发生了甲基化修饰的分子探针,利用该探针定性地考察了酶识别序列外DNA甲基化对限制性内切酶、甲基化酶与DNA相互作用的影响。该分析方法简便、快速,为研究酶识别序列外甲基化对酶与DNA相互作用的影响提供了一种新的简便方法。
【图文】：

胞嘧啶,甲基化

在高等真核生物中只发现了5-甲基胞嘧啶的甲基化形式。胞嘧啶甲基化是以S-腺苷-L-甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶的第5位碳原子上，生成5－甲基胞嘧啶和S－腺苷酰高半胱氨酸（如图1.1所示）。图 1.1 胞嘧啶的甲基化[3]Figure 1.1 Cytosine methylation

甲基化,启动子功能,启动子,转录因子

与启动子的结合[9,10]。如图1.2所示，该图表示转录因子结合未发生甲基化修饰的启动子，基因正常表达；当启动子发生甲基化修饰时，由于甲基化结合蛋白与启动子特异性地结合，抑制转录因子与启动子的结合，基因不表达。图1.2 甲基化对含有CpG岛启动子功能的影响[3]Figure 1.2 Effect of methylation on the function of a promoter containing a CpG island.1.1.3 DNA甲基化与肿瘤细胞癌变是基因表达失控的结果，而DNA的甲基化能引起基因表达的变化，
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R346

【参考文献】