乙型肝炎病毒前S1蛋白反式调节基因2的功能研究

发布时间：2020-01-30 16:24

【摘要】： 乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒,它是导致肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要原因。HBV感染致肝细胞损伤机制,很大程度上与病毒蛋白和肝细胞蛋白间的相互作用相关。因此,研究HBV的抗原成分与肝细胞内的蛋白相互作用及其机制,在一定程度上能够阐明HBV的致病机制,为寻找有效的防治HBV的方法提供理论依据。 本课题组成员应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,对于HBV前-S1蛋白反式激活作用的靶基因进行筛选,发现了前-S1蛋白可上调一未知功能基因的表达,命名为前-S1蛋白反式激活基因2(PS1TP2),我们将其成功克隆,并应用生物信息学初步探讨其结构及功能。 为研究PS1TP2在HBV感染后病毒致病过程中的作用,从人肝癌细胞中得到PS1TP2基因的全长编码序列,构建与绿色荧光蛋白融合的表达载体pEGFP-C1-PS1TP2,通过基因与荧光蛋白基因融合表达,明确它的亚细胞定位主要在细胞浆。进一步应用酵母双杂交(yeast two-hybrid)技术筛选PS1TP2与白细胞文库中的结合蛋白,包括一些与细胞免疫、信号转导、能量代谢、转录调节相关的基因。将该基因克隆至原核表达载体pET32a(+)上,构建原核表达重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta诱导进行融合表达。结果在大肠杆菌中获得了高效表达的融合蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示该蛋白的分子量约为41kD,这与预测的PS1TP2融合蛋白大小相吻合,并且通过Western-blotting检测证实了PS1TP2的表达。 我们以分子生物学技术构建PS1TP2的真核表达载体pcDNA3.1(-)-PS1TP2,以表达质粒pcDNA3.1(-)-PS1TP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液。应用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建PS1TP2激活相关基因差异表达的cDNA消减文库,筛选相关的靶基因片段,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆,多聚酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析。筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、细胞内信号转导、肿瘤及物质代谢密切相关的蛋白编码基因,推测PS1TP2在体内可能存在的调控机制的线索。 对该基因功能进行的初步了解,为下一步更加具体的生物学功能、基因表达调控的深入研究开辟道路。
【图文】：

1000~100~爵573bp图1一 1PSITPZ基因的RT-PCR扩增结果(2)PSITPZ基因的生物信息学分析 l)PSITPZ基因在染色体上的定位将基因测序结果与NCBI进行BLASTh比对分析，Psl仰2基因位于人染色体6q24.l(图l一2)。[‘.50117‘卜[一7352，.几卜卜一--一一口一，一--~--月””.R玲Gp.1鸽.......中日xv〔pZ，，，Loc。略5557-C6o卜卞55只~一十图l一 2chromosome:6;Loeation:6q24.l2)PSITPZ基因启动子活性预测及其5’一端CpG岛的分析对PSITPZ基因序列进行Blastn分析，找到其前端 5000bp序列(即6q24.l的80721一85720)，分析CpG岛发现:

图1.5X代表低复杂性区域氨基酸序列进行PHD方法预测包含提交蛋白质的拓扑结构。Pl刃0htm表示预测的跨膜螺旋空格表示非跨膜螺旋区)，Relhtm表示Pl田Dhtm预测的可靠越大)，SUBhtm表示预测的跨膜螺旋结构的集合(所有区域代表非跨膜螺旋区，.代表可靠性<7)，PHD血m表示PHDht表示Pl，ID预测的膜的拓扑结构(T表示跨膜螺旋区，i表示膜l一6)。!、】\】\1、1、L、1\】\l、、】“、!、l8899臾拍侧书夕尧冷望灼卯88、!飞、认1\!、1入1、【、l、!\1、!、l’\价1\1\1“1、!、1、1’、l’、1’、1、!、}\!仪卜卜{.、1‘、88888笑均9望玲999.............口口.....
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R373

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本文编号：2574739