莱克多巴胺兔单抗的制备与ELISA检测方法的建立

发布时间：2020-01-31 11:35

【摘要】：莱克多巴胺属于双苯烷胺类的β-肾上腺素受体激动剂(简称β-激动剂),具有广泛的生理效应,常被用于支气管哮喘、支气管痉挛和产科疾病的治疗。当其用量为临床用量的5-10倍时,又是良好的营养重分配剂和生长促进剂。其在动物机体内的残留一旦通过食物链进入人体,会对食用者的安全产生极大的危害,特别对心脏病、糖尿病、高血压、甲亢、青光眼、前列腺肥大等病人或老人儿童危害更大,甚至会导致死亡。目前我国禁止将β-激动剂等药物作为动物促生长剂使用。但长期以来,各种因非法使用β-激动剂而造成的中毒事件时有发生。为了打击非法用药,保护消费者的健康安全,迫切需要健全相关的检测方法。莱克多巴胺的检测方法与克伦特罗等其他β-激动剂相比较滞后,目前我国还没有莱克多巴胺的国家标准检测方法。因此,建立快速、灵敏、特异、有效的莱克多巴胺残留检测方法具有深远的理论意义和现实意义。本研究合成了莱克多巴胺的人工抗原,通过免疫兔子获得了免疫脾脏,利用杂交瘤技术制备了莱克多巴胺的兔单克隆抗体,建立了莱克多巴胺的ELISA检测技术,并初步构建了莱克多巴胺的ELISA检测试剂盒。其主要研究结果如下: 1.采用混合酸酐法合成了两种莱克多巴胺的人工抗原,其中一种为莱克多巴胺-BSA作为免疫抗原,另一种为莱克多巴胺-OVA作为包被抗原。通过紫外扫描法、红外扫描法和Agilent 2100生化分析仪芯片实验室试剂盒对人工抗原进行了鉴定,证实了人工抗原合成成功,测得免疫抗原分子质量为76.4kDa,并估算得到半抗原与载体蛋白的偶联比率为28:1。采用考马斯亮蓝法对合成抗原中蛋白质的含量进行测定,得到免疫抗原中蛋白质的浓度是3.62mg/mL,包被抗原中蛋白质的浓度是1.156mg/mL。 2.用合成的免疫抗原采用背部皮下注射、胭淋巴结注射和耳缘静脉注射相结合的方法免疫WHB黑眼大白兔,。免疫七次后,获得了高效价的莱克多巴胺多克隆抗血清,其中5号抗血清的效价为1:32×10~4,6号抗血清的效价为1:16×10~4。并采用饱和硫酸铵法初步纯化抗血清。 3.通过免疫WHB黑眼大白兔,同时获得了兔子的免疫脾脏,将脾细胞与处于对数生长期的兔骨髓瘤细胞240E进行细胞融合,并分装于40块96孔板中(助融剂为50%的PEG)。用HAT作为选择性培养基对融合后的细胞进行培养。利用间接ELISA、间接竞争ELISA和IgG定量等方法筛选克隆孔,初次筛选得到116个阳性孔。通过两次Sub克隆后,最终筛选出A3-2-4,A3-2-6,B5-4-4和B5-4-5共四株高特异性的杂交瘤细胞,经反复冻存及复苏,杂交瘤细胞分泌抗体稳定。通过体外培养法扩大生产兔单克隆抗体。 4.对ELISA检测条件进行了优化,得到的最佳反应条件为:包被时间4℃ 12h,一抗作用时间60min,二抗作用时间100min,底物作用时间15min。因为底物组成对ELISA检测的灵敏度有较大影响,所以试验还对底物配方进行了优化,得到TMB和H_2O_2的最佳组合为0.25g/L的TMB+0.02%的H_2O的结论。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R392

【引证文献】