慢病毒载体表达人B型利钠肽的方法学探讨

发布时间：2020-01-31 22:02

【摘要】： 目的:探索构建能表达人B型利钠肽(hBNP)的pLenti6/V5-hBNP载体的方法,以实现hBNP基因在骨骼肌成肌细胞中长久、稳定的表达。方法:体外培养SD(Sprague Dawley)鼠骨骼肌成肌细胞,并通过免疫组织化学方法鉴定所得细胞、用台酚兰染色确定培养细胞的活性并绘制生长曲线。将目的基因hBNP亚克隆到真核细胞表达载体pLenti6/V5-D-TOPO载体上,构建重组质粒pLenti6/V5-hBNP。将pLenti6/V5-hBNP及阳性对照质粒pLenti6/V5-EGFP分别用lipofectamin 2000介导转染293FT细胞,获得病毒颗粒;用病毒颗粒转染体外培养的SD乳鼠骨骼肌成肌细胞。荧光显微镜下计数确定阳性对照质粒的瞬时转染数,从而估计该基因的瞬时转染效率。加入筛选试剂以获得稳定表达异源B型利钠肽(BNP)的成肌细胞。收集瞬时转染及筛选后的细胞培养基,用酶连结免疫吸附分析(ELISA)检测试剂盒检测hBNP的表达水平。结果:聚合酶链式反应法、双酶切法及DNA测序显示hBNP基因成功地插入到pLenti6/V5-D-TOPO载体中;免疫组化显示此法培养成肌细胞质的纯度达到94 %,并且台酚兰染色细胞的存活率亦达到了94 %以上;阳性对照质粒的病毒颗粒感染细胞12 h后,在荧光显微镜下观察,其转染效率达60%以上。检测收集的上清,结果与阴性对照有显著差别(P0.01),观察至第4 w,hBNP仍持续稳定表达。结论:本实验成功构建了能在真核细胞内表达人B型钠尿肽的重组质粒pLenti6/V5-hBNP,并且取得了较高的转染效率,因此慢病毒载体介导的基因治疗在心血管疾病中有乐观的应用前景。
【图文】：

81．2．4 重组质粒 pLenti6/V5-hBNP 的构建 如图（1）将目的基因片段 pLenti6/V5-D-TOPO 载体按照 pLenti6/V5-D-TOPO 载体试剂盒的说明书，， 取

图 （7） 成肌细胞生长曲线图表 3 不同时间点 rhBNP 的分泌浓度the12thhour 4thday 7thday 10thday 14thday 18thday 21stdayCconcentra-tion of the 20.37±3.94 25.19±2.49 29.53±4.68 27.25±3.86 32.83±5.38 35.17±4.27 24.35±6.43rhBNP (ng/ml)
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R346

【参考文献】

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1 孙自勇,朱镇华,陈均勇,刘莉莉,张巍,杨庆,张菁,刘建宁;重组人脑钠素在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定[J];南京大学学报(自然科学版);2004年01期

2 朱记法,卢永昕,李锋,田俊,王玉;成肌细胞表达异源心钠素基因的研究[J];中国分子心脏病学杂志;2004年05期

本文编号：2575180