2型糖尿病相关三基因过表达小鼠模型研究

发布时间：2017-03-20 10:04

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【摘要】：2型糖尿病是内分泌代谢紊乱导致的以高血糖为主要特征的慢性疾病。在前临床研究中动物模型应用很普遍,可以模仿和再现2型糖尿病病理进程,可为药物靶点筛选、新药开发、高效治疗方式的发现提供试验对象。本研究构建能在肝脏过表达11β-HSD1并在胰腺过表达CHOP和hIAPP的三基因整合过表达载体。采用显微注射制备了转三基因F0代、F1代小鼠,后期利用高脂高糖饮食诱导出了具有2型糖尿病相关表型的转基因阳性C57BL/6小鼠成模。并结合个体生理生化指标、组织学病理图谱、基因表达调控相关分子生物学试验等评价分析了此转基因小鼠疾病模型。1)转多基因小鼠制备及鉴定。构建了三基因载体,制备并繁育了转多基因小鼠F0、F1,并对其进行阳性鉴定,选取7周龄和33周龄阳性转基因小鼠,荧光定量PCR检测器官特异性表达。结果表明,PCR三条带同时阳性时小鼠鉴定为转基因阳性;与阴性对照相比,阳性小鼠组织过表达情况理想(几倍甚至上百倍)。2)转基因小鼠中外源基因拷贝数分析。荧光定量试验得出了转基因小鼠中三个家系个体三基因拷贝数值。F1代只有6号家系与11号家系11β-HSD1基因拷贝数没有显著差异(P=0.490.05),其余两两比较结果差异均显著(P0.05)。全部阳性平均值为20.33±3.72(11β-HSD1)、7.13±1.41(CHOP)、3.76±1.10(hIAPP),反映了在小鼠上整合能力11β-HSD1CHOPhIAPP,F0代11号基因拷贝数为13.15(11β-HSD1)、3.51(CHOP)、0.70(hIAPP),11号家系F1代依次为27.29±3.1(11β-HSD1)、5.42±0.73(CHOP)、1.61±0.26(hIAPP)。结果发现,三个基因拷贝数不一致,大小趋势不同小鼠个体间保持一致,代间保持一致拷贝数,但F1代有大于F0代现象。3)高脂高糖诱导转基因小鼠表型分析。对转基因与野生对照小鼠进行了高脂高糖诱导试验(雌雄各四个处理,Tg HF-HG,Ng HF-HG,Tg Control,Ng Control),诱导期间进行了表型数据监测,定期进行糖耐量试验与胰岛素耐受试验。结果表明:随着诱导试验的逐步进行高脂高糖转基因雄性组增重显著(p0.01),饮水量组间差异不明显(p0.05);空腹血糖高脂高糖转基因雄性组略高于其他组,但呈波动状(190天,p0.05);高脂高糖转基因雄性组糖耐量减低,与野生对照组相比,胰岛素抵抗提前,从诱导2月就发生胰岛素抵抗。继续诱导表型加重(120天p0.01)。4)小鼠模型病理及分子生化分析。高脂高糖诱导处理组,心脏、脂肪等器官增重均大于对照料组(TgNc:p0.05);高脂高糖诱导处理,血清学结果表明转基因雄性组葡萄糖比对照组高,C肽含量降低说明胰岛素分泌功能受损,还产生了高胰岛素血症、高酯血症。HE切片展示了胰岛的变化,高脂高糖转基因组有的因为胰岛素分泌代偿而面积增大,少部分胰岛已经凋亡聚缩,高脂高糖野生对照组胰岛则大部分是代偿增大;免疫组化试验,胰岛大小与胰岛素分泌情况与HE切片一致,hIAPP聚积和细胞凋亡情况测定分析,转基因高脂高糖组胰岛hIAPP聚积遍布胰岛,凋亡因子Caspase 3表达增加。通过2A介导的多顺反子载体制备肝脏11β-HSD1过表达,胰腺CHOP基因和hIAPP基因的过表达小鼠,加上高糖高脂饲料诱导作用,引起胰岛素抵抗,胰岛代偿增加,产生明显糖耐受低减,引起小鼠胰岛β细胞启动凋亡,导致胰岛素分泌不足,本试验大部分转基因小鼠达到了具有向心肥胖、高胰岛素血症、糖耐量减低、胰岛素抵抗、胰岛代偿增大或凋亡等特征的糖尿病前期阶段。为将来制备转基因猪模型做了铺垫和预实验。
【关键词】：转多基因 过表达 小鼠 肝脏 胰腺 糖尿病
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1;R-332
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 英文缩略表13-14
• 第一章 引言14-22
• 1.1 糖尿病与其疾病动物模型14-16
• 1.1.1 糖尿病及其分类14-15
• 1.1.2 糖尿病小鼠模型15-16
• 1.2 糖尿病相关基因16-18
• 1.2.1 11β-HSD116-17
• 1.2.2 CHOP和h IAPP17-18
• 1.3 多顺反子载体系统18
• 1.4 转基因拷贝数18-19
• 1.5 研究现状、目的和意义19-20
• 1.5.1 研究现状19-20
• 1.5.2 研究目的20
• 1.5.3 研究意义20
• 1.6 本研究步骤与技术路线20-22
• 1.6.1 研究步骤20-21
• 1.6.2 技术路线21-22
• 第二章 转多基因小鼠制备及鉴定22-29
• 2.1 材料与方法22-24
• 2.1.1 材料22
• 2.1.2 主要试剂和仪器22
• 2.1.3 方法22-24
• 2.2 结果与分析24-27
• 2.2.1 载体构建24-25
• 2.2.2 转基因小鼠制备及阳性鉴定25-26
• 2.2.3 转基因小鼠器官特异性表达鉴定26-27
• 2.3 讨论27-29
• 第三章 转基因小鼠中外源基因拷贝数分析29-35
• 3.1 材料与方法29-30
• 3.1.1 材料29
• 3.1.2 主要试剂与仪器29
• 3.1.3 方法29-30
• 3.2 结果与分析30-33
• 3.2.1 梯度拷贝标准曲线的绘制30-32
• 3.2.2 三个家系F1代个体三基因拷贝数值32-33
• 3.3 讨论33-35
• 第四章 高脂高糖诱导转基因小鼠表型分析35-48
• 4.1 诱导试验设计35-36
• 4.1.1 分组处理35-36
• 4.2 材料与方法36-37
• 4.2.1 材料36
• 4.2.2 主要试剂与仪器36
• 4.2.3 方法36-37
• 4.3 结果与分析37-46
• 4.3.1 体重与血糖测定37-39
• 4.3.2 饲料利用与饮水检测39-41
• 4.3.3 糖耐量试验与胰岛素耐受试验41-46
• 4.4 讨论46-48
• 第五章 小鼠模型病理及生化分析48-56
• 5.1 材料与方法48-50
• 5.1.1 材料48
• 5.1.2 主要器材、试剂和仪器48
• 5.1.3 方法48-50
• 5.2 结果与分析50-54
• 5.2.1 血清学分析50
• 5.2.2 器官解剖分析50-52
• 5.2.3 功能蛋白表达分析52-53
• 5.2.4 病理切片HE及免疫组化分析53-54
• 5.3 讨论54-56
• 第六章 全文结论56-58
• 6.1 全文结论56
• 6.2 创新点56
• 6.3 本研究不足56-58
• 参考文献58-64
• 附录64-68
• 附录1 三基因载体主要序列64-67
• 附录2 小鼠配种信息67-68
• 致谢68-70
• 作者简历70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 庾蕾;刘建平;庄志雄;杨淋清;张仁利;叶小明;程锦泉;;实时RT-PCR基因表达相对定量REST~洇软件分析与2~((-ΔΔCT))法比较[J];热带医学杂志;2007年10期

2 陈丽萌,李学旺,黄利伟,李艳,段琳,张小娟;2型糖尿病小鼠(KKA~y)动物模型的鉴定和早期肾脏病理改变[J];中国医学科学院学报;2002年01期

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本文编号：257575