人乳头瘤病毒18型基因工程预防性疫苗研究

发布时间：2020-02-04 22:14

【摘要】： 宫颈癌和宫颈癌前病变是全世界妇女健康的一个主要问题。临床学，分子生物学，和流行病学调查已经证明人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是宫颈癌和宫颈非典型增生的主要病因。99％的宫颈癌患者被检测含有高危型HPVs，最常见的类型有16，18，31，和45。每年，全世界约有470，000例宫颈癌患者被诊断出来，有一半的妇女将痛苦地死亡。在美国，每年要进行5千万例巴氏试验，他们发现约有1.2百万例低度宫颈非典型增生(Cervical intraepithelial neoplasia[CIN]1)，300，000例高度宫颈非典型增生(CIN2／3)和10，000例宫颈癌。在美国，每年用于宫颈癌的筛选和治疗的医疗费估计在60亿美元。虽然在发达国家通过巴氏试验大幅度降低了这种疾病的发病率，在美国2005年仍然有3，710人死于宫颈癌。在世界其它地方，大多数妇女不能进行常规妇科检测和筛选，宫颈癌在女性肿瘤死亡率中居第2位，继乳腺癌之后。现在治疗宫颈非典型增生仅限于切除或烧蚀方法来移除或破坏宫颈组织。这样治疗的有效率大约达到90％，但可能复发和带来经济负担。外科治疗只是切除宫颈非典型增生组织，那些似乎正常的感染HPV的组织而未处理。因此根除这种感染最理想的方法是用疫苗，就像乙肝预防乙型肝炎一样，在青少年没有遇到HPV之前就注射预防性疫苗。对于那些已经感染的妇女和遭受早期宫颈癌的患者可以用正在研究中的治疗性疫苗。Merck公司用酿酒酵母表达系统研制的HPV6，11，16，，18型四价疫苗，商品名Gardasil(嘉德西哥)于2006年6月8日被美国FDA批准上市。葛兰素史克(GSK)公司采用杆状病毒昆虫细胞表达系统研制的HPV16／18型两价疫苗也已接近完成Ⅲ期临床研究，可能在2007年10月获得批准上市。本研究主要是从Genebank中查出所有的较全18L1基因序列，并按照毕赤酵母密码子偏爱性原则，优化设计出HPV18L1基因(1725bp)并合成全长序列，然后利用毕赤酵母表达载体pAO819~r表达载体，在体外构建含一个和二个拷贝的L1基因载体pAO819r-L1和pAO819r-L1Ⅱ。线形化后转化到Gs115酵母细胞，经G418抗性筛选获高拷贝工程菌并用甲醇诱导表达。构建了DNA疫苗载体pDRVI1.0-18L1，大提质粒后免疫BalB／C小鼠制备抗体，为研制HPV18型诊断试剂和抗原鉴定提供科学实验依据。表达产物采用化学发光Western blot鉴定，用自制抗HPV18 L1蛋白鼠血清作为一抗，在55KDa处有诱导蛋白免疫印迹出现。证明该表达系统能表达出HPV18L1蛋白。细胞破碎后经过超速梯度离心的纯化方法，得到的样品在电镜下观察到HPV18的病毒样颗粒。筛选出毕赤酵母高表达株后，进行了5L发酵罐的发酵工艺，菌体破碎工艺和纯化工艺摸索。实验中构建的毕赤酵母表达菌株，可经甲醇诱导表达HPV18L1晚期蛋白，表达的L1能在细胞内自主组装成病毒样颗粒，而且能在廉价的培养基上快速生长到高细胞密度，有利于在工业上进行高密度发酵。本研究为HPV18基因工程疫苗的后续研发奠定了坚实的基础。
【图文】：

乳头瘤病毒,生活周期,子细胞,基底层

图2.乳头瘤病毒在鳞状上皮细胞的生活周期.宫颈分层鳞状上皮细胞结构HPv蛋白表达，上皮干细胞的子细胞沿着基底层分化，在HPV感染基底层上皮细胞的始表达病毒的非结构蛋白，在这些蛋白的调节下，分裂的细胞数指数增长，上皮细胞少能完成，病毒蛋白随着分化而连续表达，成熟的病毒只在上皮细胞的最外层产生，抗原呈(APCs)在HPV感染的上皮组织中衰竭。HPv基因组编码8种蛋白(8个阅读框)，Ll和L2晚期基因编码病毒外壳蛋期蛋白E1和E2负责病毒的复制和转录，E4作用似乎是帮助病毒从感染细胞f6J。高危型HPv的早期基因E6和E7编码主要的转化蛋白，这些蛋白能使上皮生化，启动细胞癌变过程(如图3)。曲娜J1l幻‘，笋，.1.补、凿!!哪。，心峋!J奋匕百卜血‘，‘翻灿肠r，，，O、}\a_.上毒个﨑。呱!噩副

中和抗体,宫颈癌,蛋白,失活

这些早期基因编码的蛋白干扰了抑癌基因的正常功能:E6蛋白能和p用，导致p53失去功能，从而使p53阻止细胞分裂的功能受损，E6也能使端超过它的临界点，使细胞不能正常进行程序性死亡;E7能与视网膜母细胞(pRb)结合，激活那些使细胞周期开始的基因，导致组织增殖;E5也与细有关。因此，现在己有分子生物学数据说明HPV致癌症机理。临床学，病理毒学研究已经确定了宫颈癌发展过程。宫颈癌的致病机理是在性活动过程皮组织细胞被HPV感染，病毒持续复制和脱落导致宫颈上皮组织细胞发生变上称为CINI。接着病毒基因组从游离形式转变成整合形式，E6和E7基因蛋白EZ在这个过程中缺失或失活，疾病就发展成高度宫颈损伤(CINZ/3)和侵袭癌的发生关键点是E6和E7所介导染色体的保护者p53和pRb失活，组不稳定，抑制细胞程序性死亡。许多研究表明病毒的中和抗体能间接地免遭实验性乳头瘤病毒感染，例如将病毒样颗粒(VLPs)接种产生的兔子血nalve兔子，就能起到保护作用[8]。相似，如果接种的是L2，就能保护兔子毒引起的乳头瘤，但不能御防病毒DNA，这与中和抗体介导的保护机理相关〔Cyt。沁g丫
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

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