结核分枝杆菌WbbL蛋白质在E.coli中的可溶性表达和鉴定

发布时间：2020-02-07 04:29

【摘要】：由于结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) 的感染而引起的结核病目前是传染病首位杀手。主要原因之一是耐多药的结核分枝杆菌菌株的日益增加,而现有的抗结核药物不能有效地治愈结核病,导致结核病患者的死亡率显著增加。因此,迫切需要研发有效的抗结核新药。药物研发的关键是确定药物作用的靶标。结核分枝杆菌的细胞壁在其生存和增殖过程中起着重要的作用,并且细胞壁的组成成分和结构比较独特。被分枝菌酸酯化的聚阿拉伯糖与聚半乳糖通过衔接双糖 (L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺) 共价连接到肽聚糖分子上,以形成分枝杆菌细胞壁的核心结构。鼠李糖基转移酶的功能是将 dTDP-鼠李糖供体的鼠李糖基转移到 D-N-乙酰葡糖胺分子上而形成衔接双糖,并且鼠李糖基转移酶是分枝杆菌生长所必需的酶,因此,鼠李糖基转移酶可作为研发抗结核新药的理想靶标。为了建立体外筛选抗结核药物的分子模型,我们首先要克隆编码结核分枝杆菌鼠李糖基转移酶的 wbbL 基因,然后利用大肠杆菌高效表达 WbbL 蛋白质,为进一步研究鼠李糖基转移酶的酶促反应动力学及建立筛选抗结核药物的酶反应体系提供物质保 2 障。结核分枝杆菌 H37Rv 菌株的基因组测序工作已完成。因此 , H37Rv 基因组数据库为快速克隆目的基因提供了保障。编码结核分枝杆菌鼠李糖基转移酶的 wbbL 基因为基因组中的第 3265 个开放阅读框 Rv3265。本论文的目的是: (1) 利用 PCR 方法从结核分枝杆菌 H37Rv 菌株的基因组 DNA 中扩增出 Tb wbbL 基因;(2) 将 Tb wbbL 基因克隆到 pMD18-T 克隆载体中,经 DNA 序列测定证实为正确的基因; (3) 将 Tb wbbL 基因亚克隆到 pET16b 表达载体中并通过改变不同的诱导条件在大肠杆菌 BL21(DE3) 中表达 Tb WbbL 蛋白质;(4) 建立在 BL21(DE3) 大肠杆菌中共表达 Tb WbbL 蛋白质与分子伴侣的体系,优化表达条件以高效表达出可溶性 Tb WbbL 蛋白质;(5) 用 Western blot 方法鉴定所表达的 Tb WbbL 蛋白质为 Tb wbbL 基因产物。本论文所获得的结果如下: 1.利用 PCR 方法扩增出正确的目的 wbbL 基因从结核分枝杆菌 H37Rv 菌株基因组数据库 (http://genolist. pasteur.fr/TubercuList/) 中获得 Tb wbbL 基因的核苷酸序列 (906 bp)。根据其核苷酸序列设计一对 PCR 引物,并在上游引物和下游引物的 5’端分别引入了 NdeⅠ和 BamHⅠ限制性内切酶位点。以便将 wbbL 基因克隆到 pET16b 表达载体的 NdeⅠ和 BamHⅠ位点。用具高保真性的 LA Taq DNA 聚合酶,以 H37Rv 菌株基因组 DNA 为模板成功扩增了 wbbL 基因。 2.pMD18-Tb wbbL 的构建及核苷酸序列测定将纯化的 PCR 产物与 pMD18-T 载体进行连接,将连接产物转化到大肠杆菌 NovaBlue 菌株的感受态细胞中。用限制性内切酶酶切及 PCR 方法鉴定出阳性重组质粒 pMD18-Tb wbbL。对 pMD18-Tb wbbL 中的 Tb wbbL 基因进行 DNA 序列测定,对 DNA 测序结果进行 BLAST 分析,结果表明所克隆的 Tb wbbL 基因与结核分枝杆 3 菌 H37Rv 菌株基因组数据库中 wbbL 基因的核苷酸序列完全一致,表明利用 PCR 技术扩增出的 Tb wbbL 基因不存在任何碱基突变。 3.表达载体 pET16b-Tb wbbL 的构建用 NdeⅠ和 BamHⅠ双酶切 pMD18-Tb wbbL 阳性重组质粒,回收与纯化 Tb wbbL 基因后,将 Tb wbbL 基因连接到表达载体 pET16b 的 NdeⅠ和 BamHⅠ位点,并用连接产物转化 NovaBlue 感受态细胞。用 NdeⅠ和 BamHⅠ双酶切方法和 PCR 方法鉴定重组表达载体 pET16b-Tb wbbL,表达载体中的 Tb wbbL 基因产物的 N 端与 pET16b 表达载体上的 10 个连续组氨酸标记形成融合蛋白,便于目的蛋白的检测和纯化。 4.Tb WbbL 蛋白质在大肠杆菌 BL21(DE3) 中的表达将 pET16b 质粒及 pET16b-Tb wbbL 质粒分别转化到 BL21(DE3) 感受态细胞中。用不同条件 (IPTG 浓度、诱导温度及诱导时间等) 诱导 Tb wbbL 的表达。用超声方法破碎诱导的 BL21(DE3),对上清和沉淀组分进行 SDS-PAGE 电泳分析。结果表明 Tb WbbL 蛋白质在 BL21(DE3) 中得以表达,但以包涵体形式存在。 5.Tb WbbL 蛋白质与分子伴侣共表达体系的建立及 Tb WbbL 的优化表达将携带分子伴侣的 pKJE7 质粒转化到 BL21(DE3) 感受态细胞中,之后再将 pET16b-Tb wbbL 质粒转化到携带 pKJE7 质粒的 BL21(DE3) 感受态细胞中 (两步法)。用不同条件 (L-阿拉伯糖及 IPTG 浓度、诱导时间及诱导温度等) 诱导分子伴侣和 Tb WbbL 蛋白质基因的共表达。用超声方法破碎携带 pKJE7 和 pET16b-Tb wbbL 的 BL21(DE3),用 SDS-PAGE 电泳分析上清及沉淀组分中的表达产物,结果表明 Tb WbbL 蛋白质主要以可溶性形式存在。 6.用 Western blot 方法对 Tb WbbL 蛋白质的鉴定将 SDS-PAGE 凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,用抗多聚组氨酸的单克隆抗体及偶联碱性磷酸酶的马抗小鼠 IgG 二抗进行检测,结果表明,所表达的 Tb WbbL 蛋白质为 Tb wbbL
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R346

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