人AIF C末端截短体分子的基因克隆表达及对HeLa细胞促凋亡活性的研究

发布时间：2020-02-07 11:02

【摘要】： 细胞凋亡(apoptosis)是细胞受到生理或病理刺激后发生的自发性死亡过程。AIF(Apoptosis Inducing Factor,凋亡诱导因子)是1996年发现的一种凋亡效应分子。正常情况下,AIF蛋白定位于细胞线粒体膜间隙,当有凋亡信号刺激时,AIF分子从线粒体释放到细胞浆,再通过其核定位信号转位到细胞核中,直接引起染色体凝集和DNA的大片段(~50kb)断裂,导致细胞凋亡。 AIF的促凋亡活性不受Bcl-2过表达的影响,也不依赖于caspases的活性,在低等真核细胞凋亡、以及哺乳类胚胎发育过程中AIF也具有不可或缺的作用。与caspases等其他凋亡效应分子相比,AIF可直接诱导细胞凋亡发生而不受胞浆中其他凋亡抑制因子的抑制, AIF的这一优势对于它诱导肿瘤细胞凋亡,具有特殊意义。 Susin等研究发现,人AIF前体蛋白为67kD,包括以下几个结构域:从氨基端起,(1)氨基端100 aa长度的线粒体定位信号(MLS);(2)27aa的Spacer序列;(3)核定位信号(NLS);(4)羧基端485aa的氧化还原酶功能域(129-613位氨基酸)。AIF前体分子在线粒体被切割后,形成成熟的AIF分子,它由三部分构成:一个FAD结合结构域(122-262aa和400-477aa),一个NADH结合结构域(263-399aa)和一个C末端结构域(478-610aa)。 本室于翠娟博士成功克隆了成熟型AIF分子(AIFΔ1-120),并且证实了其促凋亡活性。在此基础上本室的刘湘丽硕士对AIF分子进行进一步截短成功构建了四种截短型AIF基因即: AIFΔ1-300(301-613aa)、AIFΔ1-352(353-613aa)、AIFΔ1-400(401-613aa)、AIFΔ1-480(481-613aa)基因,并证实这些截短型AIF分子仍具有促凋亡活性,鉴于这些截短型AIF分子仍然存在分子量过大的特点,在实际应用中可能存在困难,我们拟对AIF分子进行进一步截短,以期获得不影响AIF分子促凋亡活性的人AIF C末端截短体分子。本研究在前期获得的截短型AIFΔ1-480的基础上用PCR方法构建了人AIF C末端截短体分子AIFΔ1-500(501-613aa)和AIFΔ1-530(531-613aa),将其作为实验组基因;同时构建了阴性对照基因AIF360-480,将人AIF C末端截短体基因及阴性对照基因克隆入真核表达载体pcDNA3中,经DNA测序,证实获得序列正确。将带有成熟型AIF基因的质粒、AIF C末端截短体基因的质粒及阴性对照质粒分别瞬时转染人宫颈癌HeLa细胞,通过间接免疫荧光证实C末端截短体分子在细胞中的表达。利用荧光显微镜可观察到,人AIF C末端截短体分子表达于细胞浆中,与阴性对照组相比,实验组AIF分子的表达引起HeLa细胞出现细胞膜出泡,细胞核不均一等凋亡形态学变化。 由于人AIF C末端截短体分子的分子量较小,用Western blot不易检测到,所以我们将人AIF C末端截短体分子基因与阴性对照基因均克隆入带有Flag标签的真核表达载体pFlag-CMV4中,瞬时转染HeLa细胞,Western blot检测其表达,用激光共聚焦检测其细胞定位,证实这些C末端截短体分子定位于细胞浆中。将人AIF C末端截短体分子瞬时转染人宫颈癌HeLa细胞,用间接免疫荧光、MTT法、Annexin V分析证实了实验组AIF分子可诱导Cytc的释放并可抑制HeLa细胞的增殖。 综上所述,人AIF C末端截短体分子AIFΔ1-500及AIFΔ1-530均具有促凋亡活性。与成熟AIF分子相比,我们构建的AIF分子更小,更有利于进行肿瘤临床治疗研究,本研究为将人AIF C末端截短体分子应用于肿瘤治疗奠定了理论基础。
【图文】：

AIF的三维晶体结构

图 2 AIF 的双功能模型胞内AIF在线粒体中所催化的还原反应尚不清楚。特性说明，AIF可作为一种电子传递酶类发挥作用化还原酶的相似性，可以推测AIF可能与Cyt bc1复
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R346

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 张文霞,王立新,孙慧,郝学谦,李莉,王志光;电脉冲与恶性淋巴瘤细胞p53和bcl-2基因表达[J];中国病理生理杂志;2003年02期

2 孟艳,许浩,王蓉,姬志娟,于顺,周江宁,盛树力;阿尔茨海默病患者脑神经元存活信号转导的障碍[J];中华病理学杂志;2002年06期

，

本文编号：2577158