VEGF受体结合抑制肽的人工合成、原核表达及其活性分析

发布时间：2020-02-07 22:51

【摘要】：目的:通过人工合成VEGF受体结合抑制7肽、基因重组表达VEGF受体结合抑制7肽与硫氧还蛋白(Trx)的融合蛋白Trx-RBIP,分析其生物学活性,探讨它们作为抗肿瘤血管新生药物的前景。 方法:利用噬菌体展示技术获得的VEGF受体结合抑制7肽的氨基酸序列,人工合成该多肽,通过细胞培养阻断实验检测其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制作用。将该短肽的基因插入质粒pET-32 a(+),与硫氧还蛋白(Trx)在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达;表达产物经过DEAE阴离子交换柱纯化后用肠激酶酶切;酶切产物利用6×His纯化标签,通过Ni柱亲和层析纯化;通过细胞阻断实验检测目的蛋白Trx-RBIP对HUVEC的抑制效果。 结果:人工合成受体结合抑制7肽与VEGFR有良好结合的能力,呈剂量依赖性抑制VEGF促HUVEC增殖的作用,最高抑制率达56.2%。成功构建表达载体pET-32a(+)_Trx_RBIP,并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效胞内可溶性表达,表达的目的蛋白占细菌总蛋白的42%;DEAE阴离子交换层析纯化获得高纯度的产物,经肠激酶酶切获得到抑制肽N端游离的融合蛋白Trx-RBIP。Ni离子亲和柱层析纯化获得纯度较高的Trx-RBIP蛋白。细胞培养方法检测显示其对细胞HUVEC有良好的抑制作用,抑制效率可达24.9%。 结论:人工合成VEGF受体结合抑制肽及其硫氧还蛋白的融合蛋白Trx-RBIP,均能竞争结合VEGFR,阻断VEGF-VEGFR信号传导,抑制VEGF促HUVEC增殖的作用,具有进一步开发应用的前景。
【图文】：

图1VEGF的信号转导通路同时，肿瘤细胞产生的免疫抑制性细胞因子包括血管内皮生长因子GF)，能引起免疫应答的全身性和特异性抑制(表一1)。此外，肿瘤亦可诱特异性CTL的耐受性，同时能明显地抑制CD34前体细胞分化成为树突。VEGF抑制由肿瘤细胞上清液诱发的树突细胞分化，而且这种抑制可被抗F抗体所阻滞。表一l免疫抑制性细胞因子VEGF对肿瘤浸润性淋巴细胞功能的作用作用VEGF生长抑制化抑制子产生抑制

rrrx一L诚-erRBIp)，即pE-T32a(+)一Tn匕RBIp表达质粒构建成功。表达质粒pE-T32a(+)-T。匕RBxP示意如图4。图4表达质粒pET一32a(+)Jrx_RBIP示意图.3.33重组子测序分析对所得表达质粒EP-T32a+(--)Tn吐RBIP送上海博亚生物技术公司测序，，结果分析证明读码框正确，Enteorkniaes酶切位点、7肤序列及硫氧还蛋白肠x序列正确7女ThrASGyI耐ACCGACGACGACGACAAGGGCTGGTGGCTGCTGCTGCTGTTCCCGACCTyrTyrAPsAalLeuGlyGlyGlySerGluPheSer
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R341

【参考文献】

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1 张立国,曾革非,董婕,陈爱君,姚立红,郭元吉,张智清;流行性感冒病毒M2蛋白可溶性表达及其免疫原性的研究[J];病毒学报;2001年04期

2 马仲才,吴晓兰,曹明媚,潘卫,朱分禄,戚中田,陈景山;从噬菌体展示的构象限制性随机肽库中筛选有trkB结合活性的小肽[J];中国科学(C辑:生命科学);2002年05期

3 杜勇,徐静,李敬云,侯利华,王海涛;HIV蛋白质优势B细胞抗原表位的筛选、重组表达与抗原性鉴定[J];微生物学报;2000年03期

4 赵永同,石继红,赵宁,王俊楼,颜真,韩苇,张英起;胸腺素α_1-硫氧还蛋白融合蛋白基因的表达及其生物学功能的初步研究[J];药物生物技术;2001年02期

5 徐立,乔泰东,陈宝军,欧阳为明,丁杰,张庆华,周隽,吴昕彦,金伯泉,樊代明;胃癌相关抗原MG7-Ag模拟肽表位的筛选及测序分析[J];中华医学杂志;2000年04期

6 向军俭,钟振宇,杨红宇,黄峙,黄竞荷;噬菌体展示技术筛选bFGF抗原表位[J];中国免疫学杂志;2003年02期

本文编号：2577327