miR-124对间充质干细胞定向迁移的调控研究

发布时间：2017-03-20 12:13

  本文关键词：miR-124对间充质干细胞定向迁移的调控研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种多能成体干细胞,其来源充足,容易扩增,免疫原性低,具有自我更新和多向分化潜能,很多研究表明MSCs可迁移至损伤或病变部位修复组织损伤,成为细胞治疗理想的种子细胞。当组织受到损伤时,MSCs受到特定的细胞趋化因子(HGF、SDF、VEGF)或炎症信号的作用定向迁移至受损或炎症部位。但研究发现只有少量的MSCs可迁移至损伤区域,因此提高MSCs的定向迁移能力,增加迁移到损伤部位的移植细胞的数量至关重要,然而影响和控制这一趋化过程的分子机制还知之甚少。MicroRNAs (miRNAs)是一类长约20-24 nt的非编码RNA,通过与信使RNA(mRNA)的3’非翻译区(3'untranslated regions,3'UTRs)结合,使mRNA降解或者抑制靶基因的翻译从而在转录后水平调控基因的表达。随着miRNAs的深入研究,越来越多的证据表明miRNAs对胚胎发育,细胞增殖,迁移和分化等具有重要的调控作用。然而关于miRNA参与调控MSCs的迁移还鲜有报道,本实验旨在研究miR-124对MSCs定向迁移以及迁移相关通路Wnt/β-catenin信号的影响。本实验室前期研究表明HGF能够诱导MSCs的趋化性迁移,50 ng/ml HGF处理,细胞的迁移总数达到最大值。因此首先采用50 ng/ml的HGF刺激MSCs不同时间点(0h、0.5h、2h、5h、12h、24h), Q-PCR检测miR-124的表达变化,结果显示HGF处理MSCs 0.5 h,12h和24 h后,miR-124的表达显著下调,推测miR-124参与负向调控MSCs向HGF的趋化性迁移。接着在MSCs中转染miR-124 mimic,使miR-124高表达,采用细胞划痕实验及Boyden chamber实验检测miR-124对MSCs迁移的影响,结果表明miR-124可显著抑制MSCs的定向迁移。为了进一步验证该结果,采用miR-124抑制剂下调MSCs中miR-124的表达,发现抑制miR-124促进划痕的愈合,显著促进MSCs向HGF的趋化性迁移。接着研究miR-124调控MSCs迁移的分子机制,通过Targetscan靶基因预测软件分析,发现与细胞迁移相关的两个基因FZD4和LRP6很可能是miR-124的靶基因。为了验证FZD4和LRP6是否为miR-124的直接靶基因,我们克隆了含有两个miR-124保守结合位点的FZD43'UTR片段以及LRP6的3'UTR全长序列,并使用PCR定点突变的方法将miR-124的靶位点突变失活,从而获得野生型以及突变型的FZD4和LRP6双荧光素酶报告基因载体。使用上述载体进行双荧光素酶报告基因实验,结果表明miR-124确实能够通过与FZD4和LRP6的3'UTR结合调节这两个基因的表达。此外通过Q-PCR检测发现,高表达miR-124可显著下调FZD4的mRNA水平,虽然LRP6在mRNA水平也下调,但无显著性差异。Western blot实验证明在MSCs中高表达miR-124能够下调FZD4及LRP6蛋白的表达。Wnt/p-catenin信号通路不仅影响肿瘤的发生和转移,对干细胞的维持,增殖和迁移同样具有重要的作用。LRP6为Wnt/β-catenin信号通路的辅受体,可以通过胞外区结合Wnt蛋白和Frizzled (FZD)受体共同作用使β-catenin在胞质内累积进入细胞核,与转录因子TCF/LEF结合,调节下游靶基因的表达。本实验研究发现miR-124直接靶向FZD4和LRP6,因此检测miR-124对Wnt/β-catenin信号通路的影响。首先通过TOP/FOPFlash双荧光素酶报告基因实验检测高表达miR-124对Wnt/p-catenin信号的影响,使用Wnt3a处理激活Wnt/β-catenin信号,结果发现高表达miR-124可显著抑制细胞中的TOPFlash报告基因活性,FOPFlash报告基因没有明显变化。免疫荧光染色结果显示高表达miR-124抑制β-catenin的入核,而抑制miR-124能够促进β-catenin的入核。Western blot结果显示在MSCs中高表达miR-124, p-β-catenin蛋白水平上调,ABC (activated β-catenin)蛋白水平降低；当抑制miR-124时ABC的蛋白水平升高,而p-β-catenin蛋白水平降低。此外,研究发现高表达miR-124显著抑制Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因RUNX2和c-Myc的表达。以上这些结果说明miR-124能够抑制Wnt/β-catenin信号通路。为了进一步研究miR-124调控MSCs的迁移是否与调控Wnt/β-catenin信号通路相关,我们使用Wnt/β-catenin信号通路的激活剂Wnt3a和抑制剂FH535,采用Boyden chamber进行迁移实验的研究。检测结果显示高表达miR-124显著抑制了Wnt3a诱导的MSCs的迁移；而miR-124抑制剂对MSCs定向迁移的促进作用会被FH535阻断。以上结果表明miR-124可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响MSCs的定向迁移。细胞迁移是一个复杂精密的过程,包括细胞前端伪足的伸出,粘着斑(focal adhesions, FAs)的组装和周转以及细胞骨架的重排,因此我们最后检测miR-124对粘着斑的数量,分布以及细胞骨架重排的影响。免疫荧光染色发现,在MSCs中高表达miR-124,粘着斑的数量减少,周边／中央粘着斑的比例降低。且高表达miR-124干扰细胞片状伪足的形成,细胞骨架F-actin分布在细胞边缘,胞体中央没有明显的细胞骨架结构。综上所述,miR-124通过调节Wnt/β-catenin信号通路抑制MSCs的定向迁移。本实验阐明了miR-124调控MSCs定向迁移的分子机制,为MSCs的临床应用提供了理论基础。
【关键词】：miR-124 FZD4 LRP6 Wnt/β-catenin信号通路 MSCs迁移
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 序言12-15
• 材料与方法15-28
• 结果28-47
• 讨论47-51
• 参考文献51-57
• 结论57-58
• 综述58-74
• 参考文献66-74
• 硕士期间已发表及待发表的论文74-75
• 本研究所获基金资助75-76
• 缩略表(ABBREVIATION)76-77
• 致谢77

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本文编号：257772