核酸疫苗的基因佐剂研究

发布时间：2020-02-11 14:37

【摘要】：DNA 疫苗又称核酸疫苗,作为一种新型疫苗,DNA疫苗与传统疫苗相比有着明显的优势,如易于生产,稳定性强,成本低廉等,并可同时诱导体液免疫和细胞免疫,但DNA疫苗的免疫效果在不同动物个体中差异较大,有些疫苗在小个体的动物中免疫和保护效果较好,而在大个体动物中效果较差,尤其是在大型动物和人类中,影响了它的实际应用。如何增强DNA疫苗的免疫反应成为当前研究的热点和难点。 我们以HBV DNA疫苗作为模型抗原,选择结核分支杆菌的热休克蛋白65、金黄色葡萄球菌肠毒素A和人胸腺素α原基因作为HBV DNA疫苗的佐剂,进行DNA疫苗免疫佐剂的研究。 本研究克隆了HBV的preS2S基因、结核分支杆菌的热休克蛋白65、金黄色葡萄球菌肠毒素A和人胸腺素α原基因,构建了三种单独表达的佐剂质粒:pHSP65、pmSEA、pThyα;三种融合表达的佐剂-抗原质粒:pHSP65/HBVs2s、pmSEA/HBVs2s、pThyα/HBVs2s;以及单独的模型抗原质粒pHBVs2s。体外瞬时转染293细胞或P815细胞,除外pmSEA/HBVs2s,Western Blot均检测到目的蛋白的表达,ELISA实验证实了转染细胞表达的HBsAg与相应的抗HBsAg抗体能产生良好的免疫反应,说明表达的重组抗原具有抗原性。 DNA疫苗与其佐剂免疫小鼠。ELISA结果显示三种佐剂均可增强pHBVs2s免疫小鼠抗HBs的产生,与单独pHBVs2s免疫组相比,提高了抗HBs抗体滴度。激发抗HBs抗体滴度的高低顺序依次是pHBVs2s+pThy α、pHBVs2s+pmSEA、pHBVs2s+pHSP65、pHBVs2s。ELISPOT检测分泌IFN-γ的脾淋巴细胞数量高低顺序依次是pHBVs2s+pmSEA、pHBVs2s+pThyα、pHBVs2s+pHSP65、pHBVs2s。HBsAg特异性CTLs的杀伤活性高低顺序分泌IFN-γ的脾淋巴细胞数量高低相一致。两种融合基因组小鼠也激发了抗HBs,其抗HBs抗体滴度的高低顺序依次是pThyα/HBVs2s和pHSP65/HBVs2s,pmSEA/HBVs2s未能诱导小鼠产生抗HBs抗体。HBsAg IgG亚类的分析发现:pThyα、pmSEA和pHSP65明显提高IgG2a,促进Th0向Th1分化。
【图文】：

2.表达载体的酶切鉴定。A)重组质粒pHBvsZs酶切鉴定第1泳道为L一2000Mkar，er第2泳道为pHBvZss重组质粒助nI和APal双酶切。B)重组粒pHsP65酶切鉴定l为DL一2000Marker，2为pHsP65质粒APa了酶切后(约642bp)，3为pHSp65质粒酶切前。C)重组质粒pmSEA酶切鉴l为oL一2000arke，r2为pmSEA经EcoR工和BamH工双酶切。3为未酶切的pmsEA。D)胸素a原重组质粒(pThy)a的鉴定l为pTha质粒BmaHI和EcoRI双酶切，切约33obp的片段(Thya基因)。2为oL一2000Marker。组质粒在293细胞中瞬时表达验证上述表达载体在动物细胞系中可有效表达重组抗原及佐剂蛋白，分别表达载体P(HBVsZs、pHSP65、pmSEA、pThya)及空载体(peDNA3一Flag)93细胞，48小时后收获细胞，使用细胞裂解液将细胞裂解，离心取上清，DS一APGE蛋白电泳，以半干电泳转移仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜，封闭Flga单克隆抗体进行Westemblot检测，ECL显色系统(PekrniElmer)进

核酸疫苗的基因佐剂研究结果行显色。结果表明，HBVPrSeZS、HSP65、mSEA及胸腺素。原在293细胞中均获得了有效表达(图3)。与现有报道一致，pHBVsZs重组质粒表达的HBsAg蛋白有单糖和双糖两种糖基化形式(GP33和GGP36)(图.3a)【73]。其它各重组质粒表达的蛋白带HSP65为65Kd(图.3b);SEA为23Kd(图.3c);胸腺素。原为13Kd的蛋白带(图.3d)。pHBVsZs质粒转染的293细胞裂解液经乙型肝炎抗原HBsAg的ELIsA法分析，，结果显示在细胞内表达的HBsAg与相应的抗HBsAg抗体能产生良好的免疫反应(图.4)，说明表达的重组抗原具有抗原性。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R392

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘清;;2083名海西州饮食服务从业人员乙型肝炎表面抗原检测分析[J];河南预防医学杂志;2011年04期

2 高娅;翟丽明;;嵩县城镇职工乙型肝炎病毒感染情况调查分析[J];临床合理用药杂志;2011年17期

3 陈万荣;张玮;徐斐;;乙型肝炎表面抗原携带与抗结核治疗引起的肝功能损害之间的关系[J];职业与健康;2011年16期

4 范宁;黄晓光;;儿童乙型肝炎表面抗原及其抗体阳性率现状分析[J];检验医学与临床;2011年13期

5 ;读者·作者·编者[J];江苏医药;2011年14期

6 韩思源;王燕;;乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA、HBV DNA、HbsAg与HbeAg定量关系的分析[J];吉林医学;2011年24期

7 印良斌;刘燕;杨弋迪;;凯里地区无偿献血者血液检测结果回顾分析[J];检验医学与临床;2011年14期

8 焦凤萍;刘莉;于爱莲;王玉;于广福;;IL-18与HSV-2gD模拟抗原表位DNA疫苗的免疫效果观察[J];中国免疫学杂志;2011年07期

9 王碧玉;黄芳;;溶血对临界阴性HBsAg结果的影响及抗溶血因素干扰的研究[J];广西医学;2011年09期

10 吴春利;程小雯;吕星;房师松;王昕;;A型流感病毒M基因DNA疫苗载体构建及免疫性研究[J];中国热带医学;2011年07期

相关会议论文 前10条

1 居巍;刘君炎;;结核杆菌HSP65佐剂DNA疫苗的实验研究[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年

2 姜秀云;何昭阳;;活体电穿孔法导入DNA:牛结核病免疫接种新技术[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年

3 靳彦文;钟辉;马清钧;;恶性疟原虫DNA疫苗的安全性研究[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年

4 田洁;刘君炎;;ConA与结核杆菌HSP65DNA疫苗联合应用的研究[A];湖北省暨武汉市免疫学会第八届学术会议论文集[C];2003年

5 熊金虎;赵民;邱小萍;伍欣星;;人乳头瘤病毒嵌合型DNA疫苗的构建及其免疫效应研究[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第七届第十四次学术年会论文摘要集[C];2003年

6 江云波;方六荣;肖少波;牛传双;张辉;陈焕春;;修饰的ORF5基因增强猪繁殖与呼吸综合征DNA疫苗的免疫反应[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年

7 吴长有;;DNA疫苗与免疫记忆[A];2005全国第二届核酸疫苗研讨会论文集[C];2005年

8 崔保安;魏战勇;杨明凡;张素梅;;DNA疫苗免疫佐剂的研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集（上）[C];2003年

9 杨慧兰;葛梦林;杨太成;刘荣卿;;单纯疱疹病毒gD2 DNA疫苗免疫动物诱导的细胞免疫应答[A];2003中国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2003年

10 张冉;易新元;曾宪芳;;日本血吸虫新基因克隆及DNA疫苗的构建和保护性研究[A];中国动物学会全国第九次寄生虫学学术讨论会论文摘要集[C];2003年

相关重要报纸文章 前10条

1 蒋明 周汉桥;DNA疫苗研究取得突破[N];健康报;2005年

2 林明贵 金关甫;DNA疫苗 战胜结核的希望[N];健康报;2003年

3 ;防治早老性痴呆DNA疫苗问世[N];新华每日电讯;2004年

4 ;DNA疫苗“饿”杀小鼠肿瘤[N];医药经济报;2003年

5 陈勇;西尼罗病毒DNA疫苗开始临床试验[N];健康报;2005年

6 梅子;期待从今天开始[N];医药经济报;2001年

7 刘恕;艾滋病疫苗离我们还有多远[N];科技日报;2005年

8 李竹青;妈妈的吻有忌讳[N];保健时报;2004年

9 本报记者 王玲 柯玲;中国艾滋病疫苗与时间赛跑[N];经济日报;2005年

10 曲国斌;征服艾滋病不是梦[N];健康报;2001年

相关博士学位论文 前10条

1 靳彦文;核酸疫苗的基因佐剂研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年

2 张洪英;口蹄疫多表位DNA疫苗的免疫原性和安全性研究[D];第二军医大学;2003年

3 张静;轮状病毒分子流行病学调查及脂质体DNA疫苗研究[D];重庆医科大学;2002年

4 王涛;嗜肺军团菌mip基因DNA疫苗初步研究[D];四川大学;2004年

5 宋立强;异种同源钙激活Cl～-通道DNA疫苗对小鼠哮喘模型的防治作用[D];第四军医大学;2004年

6 时阳;MAGE-1与IL-18共表达DNA疫苗的构建及体内外功能验证[D];吉林大学;2004年

7 郭瀛军;猪带绦虫囊虫病DNA疫苗的中试及免疫效力研究[D];第二军医大学;2004年

8 张梦寒;汉城病毒M片段和汉滩病毒部分S片段核酸疫苗pEGFP-M-S的构建及基因免疫研究[D];苏州大学;2005年

9 焦解歌;猪Endoglin DNA疫苗诱导抗肿瘤血管生成机理研究[D];中南大学;2005年

10 郭慧琛;O型口蹄疫病毒多基因DNA疫苗的研制[D];中国农业科学院;2004年

相关硕士学位论文 前10条

1 张恒;鸡贫血病毒DNA疫苗的研究[D];山东师范大学;2003年

2 曾政;布鲁氏菌新型疫苗的构建及其免疫原性研究[D];西北农林科技大学;2004年

3 杨帆;鸡传染性支气管炎病毒分离株IBV_（WHNJ）M基因DNA疫苗研究[D];四川农业大学;2004年

4 杨璇;癌胚抗原DNA疫苗的构建及佐剂对其免疫效应的影响[D];郑州大学;2002年

5 黄力;口蹄疫多表位DNA疫苗的免疫原性[D];河北医科大学;2004年

6 张强哲;H5亚型禽流感病毒HA DNA疫苗的研究[D];西北农林科技大学;2003年

7 蒋英;白细胞介素12对结核病DNA疫苗效应的增强作用[D];重庆医科大学;2003年

8 蒋文明;以减毒沙门氏菌为载体传递猪繁殖与呼吸综合征病毒DNA疫苗的口服免疫应答[D];南京农业大学;2004年

9 贾文影;新孢子虫PO基因的真核表达及DNA疫苗的初步研究[D];延边大学;2010年

10 罗彬;犬瘟热病毒H基因克隆分析及DNA疫苗研究[D];中国农业科学院;2010年

本文编号：2578515