人腺激肽释放酶2的重组表达、活性测定及临床应用研究

发布时间：2020-02-12 01:27

【摘要】：目的:利用毕赤酵母表达体系表达重组人腺激肽释放酶2,获得了有活性的人腺激肽释放酶2。建立测定人精浆中腺激肽释放酶2活性方法,研究测定不同类型不育症患者精浆中腺激肽释放酶活性水平。为临床相关疾病的监测,诊断和治疗提供了关键材料和方法。 方法:通过RT-PCR的方法从前列腺组织获得编码成hK2的cDNA。构建表达载体pPICZαC-mhK2及具有3个表达盒子的pPICZαC-3mhK2。采用电转法,用重组表达质粒转染毕赤酵母X33细胞,Zeocin筛选,甲醇诱导X33细胞表达rhK2,筛选高表达rhK2的细胞株。离子交换层析纯化rhK2蛋白。SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白,使用特异性底物(H-D-Pro-Phe-Arg-pNA)检测重组hK2的酶活性。探讨了温度、pH值等对测定hK2活性的影响,设计建立测定人精浆中hK2活性的方法。 结果:获得了人hK2全长序列,构建了克隆及表达载体pPICZα-mhK2和pPICZαC-3mhK2。获得了高表达rhK2的酵母X33细胞株。离子交换层析得到纯化的rhK2,其酶活性接近正常精浆中hK2的酶活性。建立起测定人精浆中hK2活性的方法。发现多种不育症精浆中hK2的酶活性下降。 结论:毕赤酵母能够成功表达人腺激肽释放酶2,本实验获得的rhK2的酶活性接近正常精浆中hK2酶活性,我们建立起来的测定人精浆中hK2活性的方法为男性不育症的诊断提供有价值的参数,部分不育症患者精浆中的hK2活性显著下降。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R341

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本文编号：2578641