阴道毛滴虫物理图谱的初步绘制与其细菌人工染色体（BAC）文库构建条件的研究

发布时间：2020-02-14 02:47

【摘要】： 阴道毛滴虫属单细胞寄生性原生动物，在分类上属肉鞭门鞭毛亚门的动鞭毛纲，毛滴虫目，毛滴虫科，毛滴虫属，人是它唯一的寄主。阴道毛滴虫引发的滴虫性阴道炎(trichomoniasis)是世界上最常见的性传播疾病(STD，sexually transmitted disease)之一。 阴道毛滴虫的基因组约为160Mb，且至少65％为重复序列，为了完成其全基因组的测序和组装，绘制一张高精度的物理图谱尤为重要。本研究以阴道毛滴虫的EST数据、基因组WGS测序数据和Fosmid文库为基础，利用STSpooling的方法初步绘制了阴道毛滴虫的物理图谱。通过生物信息学的详细分析，实验在候选的STSs中共设计了1353对PCR引物，筛选了基因组Fosmid文库中46个superpools共17664个克隆，最后参与物理图谱拼接的有810个STSs和2555个克隆。拼接得到382个contigs和102个singlets，总长度为21.9Mb，基因组覆盖率约为12.5％。最长的congtig是由26个STSs定位在119个clones上得到的，长度约为410.2kb。 由于阴道毛滴虫的基因组比项目开始时预期的20Mb左右要大出近8倍，因此用插入片断较小、基因组覆盖度低的Fosmid文库很难绘制高质量的物理图谱，进而我们尝试构建平均插入片段大于100kb的基因组BAC文库，并利用其构建高精度的物理图谱。通过对阴道毛滴虫基因组BAC文库构建试验研究，发现：阴道毛滴虫含有较多内源性核酸酶(nuclease)，为了避免其降解DNA，需在制备琼脂糖包埋块时加入浓度为1.5％的DEPC，才得较好的抑制核酸酶的活性。通过测验BamHⅠ，EcoRⅠ，HindⅢ和MboⅠ四种限制性内切酶对阴道毛滴虫基因组的酶切情况，发现MboⅠ的酶切位点较多，随机性比较好，适宜作为MboⅠ作为部分酶切的限制性内切酶。同时还对部分酶切的条件进行了研究，确定0.08U／plug MboⅠ，37℃，60min为最佳部分酶切条件。此外还研究了1.8Kv和2.1Kv两个条件下的电转化情况，，发现高电压2.1Kv时更有利于小片断的转入；而低电压1.8Kv时更有利于大片断的转入，但转化效率较高电压有所降低。
【图文】：

阴道毛滴虫简介阴道毛滴虫是Donne于 1836年从脓性阴道分泌物和男性泌尿生殖道分泌物中首次发现的，1916年被确认为妇女滴虫性阴道炎的病原体(图1.1)。1957年发现了有效的治疗药物甲硝哇(metronidazole)， 1962年临床首次报道阴道毛滴虫对甲硝哇具抗药性。其引发的滴虫性阴道炎(trichomoniasis)是世界上最常见的性传播疾病(sTD， sexuallytransmitteddisease)之一，目前全世界每年有 170，000，000感染者【’]。研究还表明滴虫性阴道炎患者HW的感染率是正常人的6倍，与Hlv的传播有相当的关联性[2]。阴道毛滴虫作为一种性传播疾病病原体越来越受到人们的重视。、价豁灸/troPhozoite(勿P刀叽PaPPa，ands·M.W.rdr0P)图1.1阴道毛滴虫A:电镜照片B:模式图 AF:anteriorflagella(前鞭毛);RF:reeurrentfl眼ella(后鞭毛);AX:axostyle(轴杆);eo:eosta(肋);HY:hydrogenosome(氢化酶体);N:nueleus(细胞核 );pB:parabasalbody(副基体 );pG:parabasalbodyandGolgi即paratus(副基体和高尔基体)阴道毛滴虫属单细胞寄生性原生动物

BAC文库的原始材料。smid基因组文库库有48个超级池，每个超级池代表384个克隆。克隆的平为35.2kb。为了实验方便，筛库的时候使用了46个超级池。肠杆菌菌株及BAC载体oliTransforMaxEPI300[F一mcrAA(mrr一hsdRMS一mcrBC)eZAM15△laeX74recAIenJAIaraD139△(ara，leu)7697galUgaGtrjA咖frl，购自即icentre公司，用作BAc文库构建的宿主e载体eopyeontrolpeCIBAe(BamHI)试剂盒购自Epieentre公见图2.1。该载体构建的BAc文库克隆可在加入copycontrol诱ntre)时在丑coliTransforMaxEpI3oo中由1一2拷贝/细胞转换成[58一。ECo只!332
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R383

【共引文献】

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本文编号：2579346