重组VacA蛋黄抗体的制备和体外抗幽门螺杆菌作用的研究

发布时间：2020-02-26 21:24

【摘要】：目的: 采用基因工程技术大量表达重组幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)细胞空泡毒素(vacuolatingcytotoxin A ,VacA)的毒性片段,用此重组蛋白作为抗原,制备高效价的抗 VacA 的鸡蛋黄抗体 IgY,为研制 H.pylori 治疗性抗体制剂奠定基础。方法:通过大量培养并诱导重组菌 pQE30-v-DH5a,获得重组蛋白VacA。Ni2+-NTA 树脂纯化后,Bradford 法测定蛋白浓度。用该重组蛋白免疫鸡,制备抗 VacA 的鸡卵黄抗体(VacA-IgY)。用重组蛋白建立检测人血清 VacA 抗体的间接 ELISA 法,评价其抗原性。以 Helico Blot试剂盒检测结果为标准,评价所建立的 ELISA 的特异性和敏感性。用重组蛋白建立检测 VacA-IgY 的间接 ELISA 法,评价重组蛋白的免疫原性。用建立的检测 VacA-IgY 的 ELISA 法测定 IgY 产生的时间-抗体效价变化情况。收集不同免疫时间的 VacA-IgY,混合后用硫酸铵沉淀法纯化浓缩,SDS-PAGE 分析其纯度。间接 ELISA 法检测纯化抗体的效价,Bradford 法测定蛋白含量。结果: 1.目的蛋白主要以包涵体形式表达,经 NI2+-NTA 柱纯化,纯度 90%,Bradford 法测得蛋白质含量为 0.67mg/mL; 2. 所建立的检测人血清VacA抗体间接ELISA法特异性和灵敏度分别为92.0%和92.3%。重组蛋白可被病人血清所识别;3.检测 VacA-IgY 的 ELISA 法表明重组蛋白免疫鸡后的鸡蛋黄提取物可与该重组蛋白发生反应；4.重组蛋白免疫鸡后 100 天可获得高效价（1：6400）的 IgY；5.饱和硫酸铵沉淀法纯化浓缩后，可获得纯度 65％左右的 IgY，效价高达 1：12800 （ELISA 法），蛋白浓度为 25.66mg/mL（Bradford 法）。结论：1.制备的重组蛋白具有良好的抗原性和免疫原性；2.制备了高浓度、高效价、较高纯度的 VacA-IgY；3.建立了检测人血清 VacA 抗体的间接 ELISA 法，，特异性和灵敏度分别为 92.0％和 92.3％；4.建立了检测蛋黄提取物中 VacA-IgY 的间接 ELISA 法。
【图文】：

重组蛋白,重组蛋白表达,洗脱液,包涵体

图 1-1 重组蛋白表达形式的鉴定Fig 1-1 The identification of the expression form of recombinant protein marker； 2. pQE30-V induced without IPTG； 3. supernatant of pQE30-V inTG； 4. precipitation of pQE30-V induced with IPTG白包涵体的纯化破碎菌的沉淀洗涤后变性溶解，以 NI2＋-NTA 柱纯化，经 SDS-PA，纯化产物主要存在于前 3 管洗脱液中，纯度为 90%，见图 1-2

重组蛋白表达,物主,洗脱液

图 1-1 重组蛋白表达形式的鉴定 1-1 The identification of the expression form ofer； 2. pQE30-V induced without IPTG； 3. sup 4. precipitation of pQE30-V induced with IPTG涵体的纯化菌的沉淀洗涤后变性溶解，以 NI2＋-NTA 化产物主要存在于前 3 管洗脱液中，纯
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R392

【共引文献】