抗人骨髓间充质干细胞单克隆抗体ZUB1在流式细胞检测术中的应用

发布时间：2020-03-03 13:18

【摘要】： 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的成体干细胞。在一定的体内外诱导条件下，MSCs能向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、星形胶质细胞和神经原细胞分化。研究表明MSCs具有弱免疫原性和很强的免疫调节功能。这些生物学特性使其在组织工程、基因治疗、细胞移植等领域具有广阔的应用前景。骨髓是MSCs最为丰富，也是最可靠的来源。最近的研究表明外周血中亦存在MSCs，与骨髓穿刺取材相比，外周血MSCs采集方便且它们的生物学特性和骨髓MSCs相似：拥有多向分化能力，可迁入骨髓支持造血，还可迁入全身多种组织并在其中稳定表达外源治疗基因。随着研究的深入，外周血MSCs将会在组织工程、造血重建、遗传病和肿瘤基因治疗等领域和骨髓MSCs一样被广泛的应用。作为MSCs鉴定的重要组成部分，其特异性的表面标记一直以来都是人们研究的热点，但至今尚未有突破性的进展。通过单克隆抗体的筛选制备来寻找特异性表面分子是近年来开展的前沿技术。20世纪90年代以来研究者通过杂交瘤技术制备了多株人MSCs相关的单克隆抗体，目前较为特异性的有SH2、SH3、SH4、STRO-1、Thy1等，但这些单克隆抗体均与其他细胞存在交叉反应，故至今尚无人MSCs单一的特异性表面标记。在MSCs的研究中仍需要通过多个表面分子联合标记结合自我更新和多向分化潜能的特性对其进行鉴定，这给MSCs的检测和分选带来一定难度。因此，制备特异性MSCs表面分子的单克隆抗体并应用于骨髓及外周血MSCs的检测对于MSCs的研究具有重要意义。本课题组应用杂交瘤技术，以人骨髓MSCs免疫小鼠，获得了稳定分泌抗人骨髓MSCs抗体的细胞株，将其分泌的抗体命名为ZUB1。本研究旨在大量制备单克隆抗体ZUB1，同时对其进行纯化及鉴定，并以此为探针应用于流式细胞术检测MSCs，为MSCs的生物学功能研究和临床应用提供有效的工具。本研究将抗人骨髓MSCs单克隆抗体ZUB1杂交瘤细胞注射到经石蜡油预处理的BALB/C小鼠腹腔，诱生腹水，每只小鼠接种1.0×10~6细胞，两周左右后收集腹水，即可获得大量单克隆抗体。以间接免疫荧光染色法测腹水效价为1：10~4，用盐析法粗提单克隆抗体，再用离子交换法纯化单克隆抗体。经间接免疫荧光染色法将单克隆抗体ZUB1分别与人骨髓来源的细胞株HL-60、NB4、K562、U937、HEL、Jurkat、Raji作交叉反应，结果未见交叉反应，同时以免疫组织化学法检测了12个间充质和非间充质来源的组织标本(骨髓、韧带、肌腱、神经、脂肪、肌肉、血管壁、表皮、肺、肝、小肠、胆囊)，除骨髓组织外均未见交叉反应。采用间接免疫荧光染色法检测抗人骨髓MSCs单克隆抗体ZUB1与大鼠、犬的骨髓MSCs无交叉反应。以上研究表明ZUB1能与人MSCs特异性结合，这是ZUB1用于MSCs检测的前提。分别以CD105及ZUB1为探针，流式细胞术检测体外培养的骨髓MSCs的阳性率分别为(97.00±1.41)％和(97.60±1.15)％。以CD105-APC、CD34-PE、CD45-PEcy5.5、GlyA-PE单克隆抗体联合标记及ZUB1-FITC、CD34-PE、CD45-PEcy5.5、GlyA-PE单克隆抗体联合标记采用多色流式细胞术检测CD105+CD34-CD45-GlyA-正常人外周血间充质干细胞及ZUB1+CD34-CD45-GlyA-正常人外周血MSCs，初步建立了外周血MSCs的检测方法。在相同的实验条件下，取同一份静脉血标本由同一个操作者重复三次，观察结果的变异度，发现变异度较小，说明该实验具有可重复性。本研究采集了22例健康供者外周血，检测其中CD105+CD34-CD45-GlyA-及ZUB1+CD34-CD45-GlyA-外周血MSCs的含量，初步建立人外周血间充质干细胞流式细胞术检测标准。ZUB1+CD34-CD45-GlyA-外周血MSCs在外周血单个核细胞中的含量为(0.161±0.108)％，CD105+CD34-CD45-GlyA-外周血MSCs在外周血单个核细胞中的含量为(0.037±0.023)％，，性别相关性无统计学意义。综上所述，本研究得出以下结果： 1．本课题组制备并纯化的抗人骨髓间充质干细胞单克隆抗体ZUB1能与人间充质干细胞特异性结合。 2．单克隆抗体ZUB1-FITC荧光抗体可用于检测体外培养人间充质干细胞。 3．初步建立了多色流式细胞术检测CD105+CD34-CD45-GlyA-和ZUB1+CD34-CD45-GlyA-正常人外周血间充质干细胞的方法，并证明该方法是可重复的。 4．初步建立了多色流式细胞术检测CD105+CD34-CD45-GlyA-和ZUB1+CD34-CD45-GlyA-正常人外周血间充质干细胞的标准。
【图文】：

原代培养,骨髓

胞开始分裂增殖，部分区域形成细胞团簇，成集落样分布，细胞呈梭形外观。2周后细胞融合成单层，梭形突起变长，排列有明显方向性，呈漩涡状、网状、辐射状(见图2)。细胞经传代培养后， 12h完全贴壁，重新变成梭形细胞。细胞传代后生长迅速，增殖快，大约7d左右达完全融合，与原代细胞形态基本一致。图2原代培养骨髓 MSCs(14d)X100

单克隆抗体,骨髓,效价,荧光

100101102CD166CD16692.8%103104100101102103104CD吟4CD4497.3%图3骨髓MSCS表型流式细胞术检测结果1.4单克隆抗体的ZUBI的鉴定1.4.1单克隆抗体ZUBI效价的鉴定间接免疫荧光染色法检测抗体效价，免疫荧光显微镜卜观察活染的MSCS，ZUBI与MSCS特异性结合，与荧光二抗结合后细胞表面显示特异性的绿色荧光。观察发现从第5孔开始荧光消失，抗体效价即为1:10‘。1.4.2单克隆抗体ZUBI在不同来源细胞中的表达经间接免疫荧光染色法检测ZUBI与骨髓来源的细胞株HL一60、NB4、K562、U937、IIEL、丁urkat、Roji均无交叉反应(图4)。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R329.2

【参考文献】