小鼠抗人TNF单抗结合域和亲和力的预测及其中和活性表位鉴定

发布时间：2020-03-19 02:20

【摘要】：肿瘤坏死因子(TNF)是由3个分子量为17kDa亚单位组成的同源三聚体的可溶型蛋白质，主要由单核细胞和巨噬细胞产生。体内还存在分子量为26kDa的膜结合形式的TNF。TNF不仅是具有多方面免疫调节作用的细胞因子，而且通过刺激巨噬细胞、中性粒细胞和血管内皮细胞分泌多种细胞因子和介质，引起炎症反应，导致组织的损伤。TNF的过量表达与感染性疾病、自身免疫性疾病以及肿瘤等多种疾病有关。在制定多种疾病生物学治疗的策略中，TNF成为关键的靶位之一。针对TNF的中和活性单克隆抗体在动物实验中对内毒素和细菌引起的病理改变有明显的阻断作用。但鼠源性单抗在人体使用时，对人体具有免疫原性，可引起免疫反应，导致对抗体的清除，并引起免疫复合物介导的超敏反应。为了解决上述问题，建立了对鼠源性抗体改造的多种方法，如构建嵌合抗体或人源化抗体。在嵌合抗体构建过程中，最为重要的是筛选具有良好亲和力及中和活性的鼠源性亲本抗体，克隆其轻链和重链可变区基因。然后将可变区基因与人抗体恒定区基因连接，构建重组抗体基因。最后，将构建好的鼠-人嵌合基因导入真核细胞中，表达嵌合抗体。第四军医大学硕士学位论又临床上用抗TNF嵌合抗体治疗类风湿性关节炎和节段性肠炎取得了良好的疗效。美国FDA于1 998年和1 999年分别批准了用抗TNF 嵌合抗体治疗节段性肠炎和类风湿性关节炎。因此，筛选出高亲和力及中和活性的鼠源单克隆抗体，克隆出其轻、重链可变区基因，对构建高质量的嵌合抗体具有重要的意义。我室制备了一组抗人TNF单抗，根据其效价及其与天然TNF 的结合特性，从中选择了三株杂交瘤细胞，分别命名为D2、E6和 F6，，按常规方法制备腹水。腹水经硫酸按沉淀后，分别用阴离子交换层析法和蛋白A亲和层析法对其进行了纯化，抗体纯度用 SDS一PAGE鉴定。D2、E6和F6三株单抗的纯度分别达到91%、93% 和94%。高纯度抗体是亲和力和中和活性鉴定的重要保证。亲和力是治疗用单抗的重要指标之一。高亲和力的单抗所需剂量低，可大大降低治疗成本，减轻过敏反应。用间接EL工SA法测定腹水和纯化单抗的效价表明，三株单抗的效价较高，D2、E6 和F6腹水效价分别为lxlo一6、lxlo一7和lx10一7，纯化抗体效价分别为10ng/ml、2 ng/ml和2 ng/ml。中和活性指单抗可阻断TNF与其受体的结合，是治疗用抗人 TNF单抗最为主要的参数。依据TNF参与炎性病理损伤的主要机制，采用单抗抑制TNF诱导的L929细胞凋亡，单抗抑制T邓上调 ECV3O4细胞ICAMd的表达，以及单抗抑制TNF诱导NF一B的核转位等三个实验系统，分别在诱导凋亡、勃附分子表达和转录因子活化和转位等不同水平系统鉴定所选三株单抗的中和活性。结果表明，三株单抗对TNF诱导的L929细胞凋亡的抑制作用有剂量依赖关系，浓度为0.16、0.40和0.40件g/ml的DZ、E6和F6单抗，可保护ZOU/ml TNF诱导的L929细胞半数不发生凋亡。在单抗抑制TNF上调ECV304细胞ICAM一1表达的实验中，其抑制作用也呈良好的剂量依赖关系，1.0瑰/ml的D2、E6和F6单抗，对 ZOOU/ml TNF使ECv304细胞上ICAM一表达上调的抑制率，分别第四军医大学硕士学位论文为75.2%、64.3%和61.3%;三株单抗的浓度降到0.1魄/ml时，抑制率仍可达到63.5%、57.0%和61.2%。在单抗抑制TNF诱导NF- KB核转位的实验中，预先用不同浓度的三株单抗分别与TNF孵育后，加入至ECv3O4细胞培养液中。刺激lh后，收获细胞，制备细胞核提取液，用凝胶迁移实验(eleetrophoresis mobility shift aSSay，EMSA)测定核提取液中NF一B的活性。结果表明，三株单抗均可抑制TNF诱导NF一B核转位，抑制作用与加入的中和活性单抗呈良好的剂量依赖关系。浓度为10“g/m1DZ、E6和 F6单抗的抑制率分别为94.2%、64.9%和70.3%。三株单抗浓度为 0.1抖g/m1时，抑制率分别为75.1%、25.6%和49.5%。上述3种实验系统的鉴定结果表明，三株抗体均具有良好的中和活性，可作为构建对自身免疫性疾病等有治疗作用的嵌合抗体的侯选亲本单抗。在系统鉴定了三株单抗的效价和中和活性的基础上，选用D2 和F6杂交瘤细胞株，利用RT一PCR方法扩增可变区基因。将扩增产物插入T载体，克隆出轻、重链可变区基因。测序得到其核昔酸序列及其编码的氨基酸序列，经同源性分析，在现有数据库中没有发现完全一致的核普酸和氨基酸序列。获得的序列符合抗体可变区基因的特点，为功能性抗体的可变区基因。该基因序列在构建对炎症、自身免疫性疾病等有治疗作用的嵌合抗体等方面有巨大的潜在应用价值。生物信息、学(bioinformatics)是应用信息学技术大规模的分析、处理和研究大分子的一门科学。借助生物信息学的研究成果，利用蛋白质间相互作用的模件，模拟TNF与单克隆抗体的相互作用，精确计算各种相互作用力，定位抗体识别的表位。发现 F6单抗与TNF的亲和力(一299.92kcal)接近阳性对照(美国FDA 批准临床使用的cAZ单抗)的水平(一302.29keal)，其结合 TNF 的表位也比较好。D2的亲和力稍低(一252.69kcal)，但其结合的第四军医大学硕士学位论又 TNF表位十分理想。E6的亲和力相
【图文】：

亲和层析法,蛋白A,单抗,亚类

分别采用不同的方法纯化不同亚类的抗体。2.2.1采用蛋白A亲和层析法纯化D2单抗(亚类为IgGZb)(图2)。图2蛋白A亲和层析法纯化D2单抗(IgGZb)

阴离子交换层析,单抗,硕士学位论文

QFF阴离子交换层析法纯化E6(工gGI)
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

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