人骨髓间质干细胞的生物学特征和体外成骨分化的研究

发布时间：2020-03-20 20:09

【摘要】： 间质干细胞是成体干细胞的一种，它具有很强的自我增殖能力和多向分化潜能。大量研究表明，体外培养的骨髓间质干细胞在合适的诱导条件下，可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、成腱细胞和神经元样细胞等多种非造血组织特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞。骨髓间质干细胞取材方便、易于在体外分离、纯化，可在体内外表达多种治疗性的外源目的基因，因而近年来已成为基因和组织工程领域中研究的热点。本课题分离和纯化了人骨髓间质干细胞，应用实验血液学，免疫组织化学和分子生物学等方法，着重研究了人骨髓间质干细胞的基本生物学特性，体外的增殖调控和成骨诱导，以及对骨髓间质干细胞应用于基因转染领域的初步探讨。主要结果如下： 1、人骨髓间质干细胞的基本生物学特性取胸部外科手术无血液系统疾病病人肋骨，采用密度梯度离心法分离单个核细胞(淋巴细胞分离液密度为1.077)，以5×10~5/皿的细胞浓度接种，培养的MSCs贴壁后，细胞胞浆充盈，外形呈梭形，9天后瑞士-吉姆萨染色，可见由10个以上大小与形状均一的细胞组成的集合，即间质干细胞集落，如继续培养，2周后，集落生成增大，并相互融合，形成融合层。当MSCs生长到亚融合状态时，按1：3的比例进行传代培养，传代2次后，MSCs达到纯化。选MSCs生长状态良好时，测定细胞的生长曲线。根据MSCs的细胞生长曲韩，利用公式计算MSCs的倍增时间为31．4 ，J。时。表面抗原测定，MSCS CD45阴性，属非造血组织细胞。 2、几种因素对人骨髓间质干细胞增殖的影响为了获得大量的、状态良好的MSCS应用于基因转染和组织工程，本实验采用MSCs集落为检测指标，检测了不同的血清浓度，不同的细胞浓度，多种细胞因子和条件培养液对MSCS增殖的影响。结果显示：不同浓度血清对MSCs集落生成的影响：在5浙30％的血清浓度范围内，间质干细胞集落的产率随血清浓度的升高而增加，当血清浓度超过30％时，集落的产率不再增加。不同细胞浓度对MSCS集落生成的影响：将纯化的MSCS制成单细胞悬液，按 200个／M和 500个／M的浓度分别接种 2组，每组7 M，培养一段时间后每M随机挑取5个集落，计数每个集落的细胞数。结果：200个／M组，培养至第 9天时检测，未见集落形成，在培养的第13天检测，可见集落形成，且细胞明显老化，每个集落的细胞数为 55．77土34．80；500个／皿组，养培 9天后己形成明显的集落，每个集落的细胞数为78．97士43．04。两组细胞的倍增时间：200个／M 组为53．8小时；500个／皿组为34．3小时。本实验狈定了几一6（nng·＊厂‘），工一3（＊U·＊广），工一1。门0《m。工·1叫），＊＊（5＊·m＊），＊－＊F（工00＊·m＊），＊F 日（Zng·m工），工＊Y（＊ng·m＊）等7禾因子对骨髓间质干细胞集落生成的影响：工＊6（50ng·。＊），工－3（10U·m＊），＊肛（5＊·。＊）三组与对照组才比均具有显著性差异（p＜0．01），IL一IQ（10－’mol·1－‘）组与对照组比较存在差异k．05L 这四种因子均可提高间质干细胞集落的产率，促进间质干细胞的增殖，其它三组州F－Y（25ng。1－‘人 GM－CSF（mong＠＊广）和TGP－p（Zng·m＊‘）与对照组比较无明显差别（p＞0．05）。bFGF在3ng＠。＊－7ng＠。工浓度范围内，bPG厂浓度增加，间质干细胞集落的生成也增加。与对照组比较， sns·M－‘，7us·觎‘组明显促进间质干细胞集落的生成hu．01）， 7ng·mlrt组比 sng·ml＊组作用更强（P＜0．05）。bFGF浓度超过 7ng·ml‘ 时，对间质干细胞集落的生成无明显刺激作用。 MSC（M和 BRL（M对MSCS集落生成的影响：MSC｛M门0们促进骨髓间质干细胞集落的形成，与对照组比较有明显差异 k①．05人BRL｛M门0们也促进骨髓间质干细胞集落的形成，与对照组比较，差异显著ko．01人BRL｛M门0们对间质干细胞增殖的促进作用比MSC－CM（107）更强b＜0．05）。 3、体外诱导人骨髓间质干细胞向成骨细胞分化体外培养MSCS至亚融合，加入成骨诱导剂继续培养2周后，，检测碱性磷酸酶（AKP）的活性。结果显示：诱导前，A肝活性呈弱阳性；诱导后，AKP活性呈强阳性。在持续诱导 64周后，Von Kossa 染色鉴定矿化结节的产生，结果显示：存在阳性的黑色或深褐色的区域，有矿化结节产生。说明MSCS在体外诱导条件下，可表现出成骨倾向。本实验己证实体外成骨诱导4周后的骨髓间质干细胞表达 BMP－二基因。且1互 4、人骨髓间质干细胞在基因转染中的应用腺相关病毒（AAV）作为一种基因转染的载体工具，拥有其他转染载体无可比拟的优越性：对人体无毒性，无致瘤性。本实验采用携带 GFP和 Neo”基因的 rAAV作为转染载体，转染受体细胞MSCs。结果显示：MSCS可被AAV载体基因转染，荧光显微镜下清晰可见结构明显、带有荧光的MSCS。
【图文】：

骨髓间质干细胞,集落

图1培养9天的骨髓间质干细胞集落(xloo)fig1.TheeolonyofMSCatgdayseulture.(XIOO)瓢翼鬓一图2骨髓间质干细胞融合层(x10

骨髓间质干细胞,集落

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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R329.2

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