原位PCR检测定位豫医无毛小鼠无毛基因

发布时间：2020-03-21 13:05

【摘要】： 无毛小鼠(hairless mice)是一种不同于裸小鼠(nude mice)而皮肤和毛发结构发生遗传突变的小鼠新品系。国外已有多种无毛小鼠品系，而国内有关无毛小鼠这方面的报道却很少。1990年，河南省实验动物中心在昆明种实验小鼠繁殖群中，发现一株无毛突变小鼠。经过10多年的研究，已建成一无毛小鼠的近交系，命名为豫医无毛小鼠(Yuyi Hairless Mice，简称YYHL)。该种小鼠出生时被毛生长正常，2—3周开始脱毛，经大约2周时间除胡须外其余被毛全部脱净，并终生保持无毛状态。该种小鼠生长过程中，除被毛的脱落外，头部和体侧皮肤也逐渐显得松弛、出现皱褶，时值壮年(7-8月龄)已“老态龙钟”；松弛的上睑皮肤甚至遮盖双眼，致使行走觅食困难。该突变无毛小鼠自然寿命大约是10个月余，仅为正常昆明小鼠寿命的一半。其胸腺退化也早于野株小鼠、免疫力下降，特别是细胞免疫。根据孟德尔遗传学原理，分析其遗传图谱，证实脱毛性状是由于常染色体上单一隐性基因发生突变所致。为了进一步研究造成无毛小鼠相应表现型变异的遗传学根源，本实验拟检测定位无毛基因，对豫医无毛小鼠进行深入的分子生物学研究。复习文献，根据GenBank存储的类郑州大学2002年硕士毕业论文原位PCR检测定位豫医无毛小鼠无毛基因似的突变株无毛基因全序列设计引物。应用原位PCR的方法，检测定位豫医无毛小鼠胸腺、脾组织切片和骨髓细胞、淋巴细胞内的无毛基因。确定豫医无毛小鼠与其他得到国际公认的无毛小鼠，如：rhlno mice，hairless mice等基因结构万面的同源性。结果 1．石蜡组织切片上突变基因的获得：利用基因文库中的无毛基因全序列设计一对引物，即引物 P；和 Py引物 5”端用生物素标记。应用豫医无毛小鼠的胸腺、脾做石蜡组织切片，正常昆明小鼠的胸腺、脾的组织所做石蜡组织切片作为对照。应用蛋白酶K 改变石蜡切片上组织的通透性，用多聚甲醛固定组织，乙醇水化。热启动：在 PCR扩增前，部分 PCR反应混合液（不加 Taa DNA多聚酶）94oC预热 smin，然后再加入 Taq DNA多聚酶。每张玻片上加4oUL＊＊R反应液，盖上盖玻片，液体石蜡封片。于94℃热板上变性smin，50℃复性10min，72OC延伸10min；共进行2 5个循环。对照：正常昆明小鼠的石蜡切片；豫医无毛小鼠石蜡组织切片不加引物对照和不加 Taq DNA聚合酶的对照。反应结束后三氯甲烷，酶学方法检测杂交信号，在显微镜观察结果并记录。确定有杂交信号吸附在组织上。 2．染色体标本的获得：用戊巴比妥钠麻醉豫医无毛小鼠和正常的昆明小鼠实验群。腹部酒精消毒，置超净台中，取心脏血大约 lml，用淋巴细胞分离液分离，PB S冲洗数次，以去除淋巴细胞分离液。同时取小鼠脾脏，，边研磨边滴加 yMI 640，用淋巴细胞分离液分离，PBS冲洗。心脏血和脾脏的淋巴细胞在RPMI 1640 培养液中培养 72h，培养时在 RPMI 640培养液中添加刀豆蛋白 A， 2 郑州大学2002年硕士毕业论文原位P＊R检测定位豫医无毛小鼠无毛基因培养至 70h时，向 yMI 640培养液中加秋水仙素，培养至 72h，收集培养液离心，0刀SMKCI低渗50min，离心，甲醇／冰乙酸固定 3次，把固定好的淋巴细胞均匀平铺与载玻片上（玻片用多聚赖氨酸处理人取幼龄的豫医无毛小鼠和相当月龄的正常昆明小鼠，腹腔注射秋水仙素，作用4h后，将小鼠断颈处死，分离股骨，用注射器冲洗骨髓腔，离心收集骨髓细胞，0刀SMKCI低渗80而n，离心，甲醇／冰乙酸固定。把固定好的淋巴细胞均匀平铺与载玻片上（玻片用多聚赖氨酸处理人这样就准备好了处于分裂中期的染色体涂片。 3．染色体G显带：将步骤2中制备好的淋巴细胞和骨髓细胞的染色体涂片，在室温放置一星期后，用胰酶法显示G分带。染色体涂片于37OC在胰酶中处理Zmin，PBS冲洗，Giemsa染色，观察条带清晰度和分散情况，选择比较好的涂片用甲醇／冰乙酸脱去 Giemsa的颜色，用于PCR反应。 4．染色体涂片上突变基因的获得：染色体涂片用多聚甲醛处理后，选取染色体分散好的标本。热启动：在PCR扩增前，部分PCR 反应混合液（不加 Taq DNA多聚酶）94oC预热 5 min，然后再加入 Taq DNA多聚酶。每张玻片上加 40 uL PCR反应液，盖上盖玻片，液体石蜡封片。于94oC热板上变性smin，50oC复性 10min，72oC 延伸 10min；共进行 2 5个循环。对照组：正常昆明小鼠的染色体涂片；豫医无毛小鼠染色体涂片不加引物对照和不加 Taq DNA聚合酶对照。三氯甲烷洗脱，酶免疫学检测。显微镜下观察延伸标记信号。杂交过的染色体标本Gimsa染色。显微镜下观察杂交信号好。选择染色体分布比较开的，染色体形状比较清晰的视野记．二号郑州大学2002年硕士毕业论文原位PCR检测定位豫医无毛小鼠无毛基因录。实验结果为进一步研究豫医无毛小鼠的生物学特性、
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R392

【参考文献】