26肽蜂毒素与基因变构人白细胞介素2嵌合蛋白的原核表达、纯化及活性测定

发布时间：2020-03-21 17:53

【摘要】：①目的：通过定点诱变的方法，构建基因变构IL-2(~(88)N→R)的重组克隆；将26肽蜂毒素与基因变构的人IL-2在基因水平连接，构建嵌合体蛋白克隆并在原核系统中高效表达，并进行初步纯化和抗原性检测。②方法：从一名健康男子的扁桃体细胞中分离T细胞经PHA刺激活化后，提取细胞的RNA为模板，逆转录构建cDNA文库，经套式PCR扩增出编码IL-2的基因，插入T-A载体后获得编码天然IL-2的克隆，核苷酸测序证实成功后，自行设计含有突变位点的引物，利用重组PCR技术，进行定点诱变构建基因变构IL-2(~(88)N→R)的重组克隆，DNA测序确认变构成功。利用剪接式重叠延伸(spliced overlap extension，SOE)技术在26肽蜂毒素与基因变构IL-2的基因之间导入四个易形成空间结构的氨基酸残基组成的连接肽(Gly_4Ser)_3，构建嵌合体蛋白的基因，克隆到原核表达载体pGEX4T-2中，，重组质粒转化宿主菌DH5α，经IPTG诱导表达目的融合蛋白，蛋白纯化后经SDS-PAGE电泳与Western blotting鉴定。③结果：获得了基因变构IL-2的编码基因克隆及表达嵌合蛋白的重组菌，并得到纯化的融合蛋白和Thrombin酶切后的嵌合蛋白；Western blotting鉴定表明纯化的重组蛋白与人IL-2的单克隆抗体有良好的抗原特异性。④结论：在原核表达系统中成功表达了嵌合蛋白，纯化后的蛋白有望是一种新型免疫调节剂，为进一步在真核细胞中表达以及研究制备低毒、高效的新型细胞因子类免疫调节剂药物奠定基础。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

【共引文献】

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本文编号：2593711