mae和misgurin两种基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

发布时间：2020-03-21 17:10

【摘要】： MAE是本实验室设计的具有抗菌活性的杂合肽，它是以MagaininⅡ(残基4-14)和Melittin(残基2-13)为亲本，并对序列进行了优化改造后设计出的杂合肽。本文对杂合肽的高级结构进行了模拟，得到了该杂合肽高级结构的初步信息。并以已构建的载体pTYB2-mae为模板，通过PCR扩增出融合基因mae-imein-cbd，将其克隆于表达质粒pPIC9K中，通过鉴定并测序正确后，电转化真核表达宿主——毕赤酵母菌株GS115，通过营养缺陷型培养基筛选重组子，再利用G418抗性筛选出整合有多拷贝外源基因的重组子。按表达手册进行表达实验，挑选出具有高分泌表达水平的菌株，并采用不同的诱导时间、pH值、甲醇诱导浓度进行表达比较，优化出适宜的表达条件。采用优化的表达条件进行大量发酵，对上清液超滤浓缩脱盐后，采用几丁质基质进行亲和层析分离目的蛋白，溴化氰切割，琼脂孔穴法测抗菌活性。结果表明，纯化后的产物具有明显的抗菌活性。 Misgurin是一种从泥鳅中分离出来的，具有强抗菌活性而无溶血活性的抗菌肽，因而有望成为一种抗菌新药。本文根据GENEBANK登录的氨基酸序列，同时考虑构建和表达的需要，化学合成了misgurin基因和接头，采用一种新的策略，在体外将基因多拷贝同向串连，并将其克隆于表达质粒pPIC9K中，通过鉴定并测序正确后，电转化真核表达宿主——毕赤酵母菌株GS115，通过营养缺陷型培养基筛选重组子，再利用G418抗性筛选出整合有多拷贝外源基因的重组子。按表达手册进行初步表达实验，经SDS-PAGE检测表明，酵母重组子分泌出了目的蛋白。
【图文】：

n两种基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达2.基因和接头的连接基因和接头最终连接产物2%琼脂糖凝胶电泳结果如图18，，从图中可以看出连接产物能形成明显的一条条带，且基因片段长能高达IKb以上，也即能获得较高的拷贝数(20个拷贝左右)。出于MISGU刃N是阳离子多肤，过高的拷贝数会影响表达量[l“’]的考虑，我们只回收4个拷贝的串连基因。100b卫—500bP—M:100bPladder1000bPLanel:连接产物图18最终连接产物琼脂糖凝胶电泳图3.转化子的PCR鉴定及测序连接产物转化大肠杆菌受体菌DHS。，涂布在含Amp的抗性筛选LB平板上。设置的对照与预期相符，说明转化过程正常。挑取20个转化子

结果进一步的支持了关于抗菌肤是无受体介导的过程。“穿孔模型(barrel一stavemodel)”和“地毯模型(e抑etmodel)”是目前关于抗菌肤膜活性作用过程的两种最常见的模式。它们的作用模式图如图3。图3:抗菌肤的两种作用模式，左边为地毯模型，右边为穿孔模型暨南大学硕十毕业论文
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：Q78

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本文编号：2593656