副溶血弧菌耐热直接溶血素基因的克隆表达与鉴定

发布时间：2020-03-22 15:17

【摘要】：根据已发表的副溶血弧菌耐热直接溶血素(TDH)的核苷酸序列设计了一对引物，并在5’-端与3’-端分别增加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，应用PCR技术从致病性副溶血弧菌wVp_2株扩增了tdh基因，PCR产物经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切回收后定向插入pGEX-4T-1表达载体，测序分析结果表明tdh基因的开放阅读框(ORF)为570nt，编码由189个氨基酸组成、分子量为23kDa的耐热直接溶血素。应用DNAman、Antheprot 5.0、ClustalW等分子生物学软件分析，显示所克隆的tdh基因与Genebank副溶血弧茵的tdh1基因(M10069)同源率达99.82％，仅在368位与参考菌株有一碱基差别(A-G)；推导的氨基酸仅123位由天冬氨酸替代了TDH1的甘氨酸，同源率达99.47％，前24个氨基酸是较强的疏水性区域，可能组成信号肽。 将PCR产物与pGEX-4T-1构建的重组质粒成功的转化了E．coli DH5α与BL21(DE)工程菌株，SDS-PAGE分析表明经IPTG诱导后重组菌在迁移率为49kD位置上出现一条明显的蛋白带，而其载体自身带有26kDGST蛋白带消失，，由此推断，49kD蛋白是由tdh基因编码的23kD蛋白与gst基因编码的26kD蛋白连接后形成的融合蛋白。Bio-rad Gel Doc2000，QuantityOne软件分析表明该融合蛋白的表达量占菌体总蛋白含量的32％，表达产物主要以不溶性蛋白的形式存在于菌体裂解沉淀中，利用5mM二硫苏糖醇、1.5％十二烷基肌氨酸钠和0.2％脱氧胆酸钠等变性剂对不溶性蛋白处理后，能使大部分不溶性蛋白转变为可溶性蛋白，通过GlutathioneSephrose 4B亲和柱层析和Thrombin酶切将GST-TDH融合蛋白从BL21工程菌分离出来。免疫学分析证实纯化的表达产物能被副溶血弧菌胞外产物的特异性抗血清所识别，抗血清的ELISA效价为1：32000，当抗血清稀释度为1：1000时，能检出的最低TDH蛋白量为31.25ng。DNA序列分析和免疫学分析证明所克隆的基因是副溶血弧菌的tdh基因，且重组菌表达 福建农林大学硕士论文 的TDH与原始菌株产生的TDH抗原性一致。副溶血弧菌的才瀚基因克隆 与表达，为在单因子水平上研究副溶血弧菌TDH的毒力、致病机理以及 诱导宿主免疫应答方面的作用奠定基础。
【图文】：

菌;抽提的重组质粒经BamHI和EcoRI酶切后，分别得到大小约为skb和57Obp的两个片段，与预期的载体片段和目的基因片段大小一致，表明了重组质粒构建成功(见图3)。再将含目的基因的重组质粒转化工程菌E.coliBL21，得到重组菌，命名为PWB。2345678910117(X)bP1.50bPDNAladder2.vP北京株3.8#菌株4.23#菌株svp31#5.wvPI7.wvPZ8.wvP39.wvall10.wvaIZ11.wva】3570bP图1副溶血弧菌才叨二基因的PCR扩增电泳图谱Fig.1PCRamPlifieationoftdhgeneofvibrioParahaemolytieus234561.IkbDNAladder2.50bPDNAledder70bp，.酶切pGEx一wVpZ一BLZI质粒4.酶切pGEx一wvPZ一DH5a质粒5.酶切PET28-wVPZ一BLZI质粒6.酶切PET28一wVPZ·DH5a质粒图3重组质粒的BamH1/EcoRI酶切鉴定结果Fig.3CharacteriZationofthereeombinantPlasmids妙BamH砚

结果与分析1.PCR扩增与重组表达质粒的构建通过PCR反应扩增副溶血弧菌wVp:的tdh57obP(见图l)，与预计片段大小一致。将PcR入pGEX一4T-1表达质粒(见图2)，转化工程菌E菌;抽提的重组质粒经BamHI和EcoRI酶切后，和57Obp的两个片段，与预期的载体片段和目的了重组质粒构建成功(见图3)。再将含目的基因E.coliBL21，得到重组菌，命名为PWB。234567891011
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：Q786

【参考文献】

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本文编号：2595225