杀蚊球形芽孢杆菌pLG质粒的序列分析及复制单元特性

发布时间：2020-03-22 14:27

【摘要】： 球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus，B.s）菌株是防治蚊虫的重要病原菌，，由于其的杀蚊毒素基因是位于染色体上，质粒的分子量小，所能提供的生物信息量少，因此对Bs质粒还未见有关生物信息学方面的研究报道。本研究对通过对Bs Lp1-G株分离到的隐形质粒的全序列测定及详尽的生物信息学分析，首次报道了Bs小质粒的分子遗传学信息。通过改进的QIAGEN质粒试剂盒法，获得了高纯度质粒DNA。根据酶解的结果，选择了HindIII的一组片段，大小分别为6.4 kb、4.3 kb和0.75 kb，将其克隆到pUC18并进行序列测定。同时在各已测片段接头处利用PCR技术通过Primer Walking法覆盖测序gap，并判定各片段的拼接方式，从而获得质粒全序列。测序结果显示全长11,066 bp，平均CG％为37.92%。经过软件识别和综合分析确定其编码序列即ORF为23个。基因编码密度为2.078个基因/kb，编码链的平均长度为416 bp，编码序列占全序列的百分比为86.6%，该质粒的Genbank登记号为AY325804。通过与公共数据库比对，发现可以识别功能的ORF共有4个。其中最重要的是与质粒复制所必需的rep基因，pLG的rep基因与已测序的苏云金芽孢杆菌质粒 pBMB9741和苏云金芽孢杆菌质粒pGI1的复制蛋白基因在氨基酸序列上分别有47.53%和40.89%同源性。并根据rep基因的同源性比较，判断pLG的复制模式归属与RCR模式的GroupIII组，即pC194家族。ORF16与已测序的苏云金芽孢杆菌质粒 pGI3编码的一个23.1 kDa蛋白在氨基酸序列上有30.89%的同源性，但功能未知。并且在这个ORF中存在的ATP/GTP结合结构域独有的P-loop结构。另外ORF7和ORF8分别可能编码富脯氨酸转运蛋白和膜结合水解酶基因，同时这两个OFR都存在信号肽序列。为了研究其复制单元的特性，我们将pLG质粒用酶解为大小不同的片段，分别克隆到载体pAW001上，转化Bt 4Q7观察其复制能力。初步结果表明重组克隆子pAW2的插入片段含有 pLG的复制单元，转化率约为3x10~3个/(g DNA。
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(武汉病毒研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R346

【参考文献】