胞内信号分子Dokl-PTB结构域的表达纯化与功能研究

发布时间：2020-03-22 13:28

【摘要】： 研究目的：阐明Dokl-PTB结构域与RTK相互作用的结构基础和特异性，并揭示其生物学功能确切的分子机制。酪氨酸蛋白激酶下游分子(Downstream of tyrosine Kinase，Dok)是一类最近发现的新型酪氨酸残基磷酸化蛋白质，是广泛存在于多种细胞内的信号分子，其作用可以看作是信号传递网络中的一个节点。激活状态的受体型酪氨酸蛋白激酶(Receptor Tyrosine Kinase，简称RTK)使Doks的特定位点的酪氦酸残基磷酸化，并通过其后的蛋白质磷酸化反应传递信号，参与信号转导系统中细胞应答特定刺激，，并介导产生存活、增殖、分化、黏附和迁移等生物学效应。郑川人学Zde年研允T毕业论文内仆号分于k卜P＊8结构域的R达、纯化与功能研究 DOkS还在神经细胞发育中的迁移和运动的调节，在神经元轴突导向、成束以及细胞骨架结构形成中，起着非常重要的作用。因而对于DOkS的6）f究对在阐明肿瘤发生、神经系统退行性变和损伤修复机制具有重要的理论和实践意义。RTK介导生物效应的特异性，不仪耿决于配体分子和RT K腆外域的特异亲和，并且还取诀于 RTKjg内域作用的特异性底物分于l’］。原型成员 DOki最早是作为一个酪氨酸残基被磷酸化，并与a120ka。GAP结合的负性调节于而被发现的，可以被RTK（EGFR、PDGFR、IR、Eph）、抗原受体吓C l。RllB）和厂l”K（V－Src、V－Abl、1”。c和 p210bcr－abl融合癌蛋白）所磷酸化l”‘－’＊来源于 DOkl／小鼠的骨髓细胞、T细胞、小鼠肚胎纤维十细胞（jcl’。）比来源于野尘型小鼠的细胞在受到生长因于刺激后表现出更高水平的增殖，而且在MEFS细胞中可以观察到 VA爪被 l（。过量和过久的iM活【＼在B细胞中可以观察到能够抑制抗原受体介导 MAPK的激活和细胞增 9旷‘l。DOk山 48个氨基酸伐丛组成，立体结构尚未测定。序列分析和结构预测显示：它含有多个介导蛋白质相互作用的区域，其中 M IPI 20为 PH结构域， NI3 IQ260为 PTB结构域，梭基端尾巴含有 10个潜在的酪氨酸戏丛磷酸化位点和7个PXXP基序。研究表明，PH结构域能够和细胞）JR上的酸性磷脂结合，将 DOk锚定于细胞内表面，从而靠近 u·K卜‘；而PTB结构域具有与SHZ结构域相似的结合特性，也能够与磷酸化的酪氨酸残基结合！’，’］；PXXP基序可以作为SH3结构域的停泊位点；己有文献报道 DOk在应答 EGF刺激时其酪氨酸伐基被磷酸化［’‘·仙l，磷酸化的酪氨酸残基可以和含有SHZ结构域第3页卜川｛人寸二W口丫矾＞H－牛咐，沦久山mU分广u人卜＊＊D纶川议的衣达、纯化‘八M劝乃广象NCK、CSK、RasGAP ti信号分于结合。但目前对于Doki是怎样在牛长因于刺激后影响EGFR信号途径和后续功能的，及两秆之 0。川Wt）J的结合机制尚缺乏沈入认以。卜！y结构域仆为＊。；k。的分f 识别元件，在1人）k。介纤的生物学功能性中发挥着选择性结合上游儿V分厂的什川。虽然所订的D；；k。成员均能与＊”K结合，但个同的h；k。成员冈其川卫纠构域1’1叮F别，’－’亏不同的！订K有不同的结合特性。1）。M和1）。小2冈儿序列问圳叫1；较；气、组织分布较一致、基囚进化关系较近，所以O许多川近功能。关于RTK信弓特异性己七许多研究资料，少数的儿种受休llJ“以父用多种底物卜’“］。另外，也何资料表明特定的仲泊分于能够介导特异的生物应答卜‘’‘“’‘’‘。其叫。实验证明DOM能与m！V的卜1086和叭门48两个位点特异性结介，这此纠论人扣以究卅供了尸u沦提示和实验力’法依据。方法：为深入认识＊叭卜卜『rB纳构域在介导RT K信号转皆中的作川，阐明DOH－P”PB结构域与RT K相互结合的结构基础，本研究采用重组＊NA技水构胜了OS＊十‘IB结构域的融合蛋白的衣达质粒，在大肠l。1厅j中实观了侧介蛋门的表达：利川交联葡聚糖亲川店村一b化平纠蛋0’【；刊川GS丁1‘；川＊。一技术，证明＊。k的P＊B 结构域，是否能够特异性地与被激活的EGFR结合；利用小肽抑制 ’大验，证明激活11） EGFR 驯；个磷酸化的酪氨酸残基参与了与＊＊hi．P＊B 纠构域的结合；川”三维＊＊R解析斓定E＊FR 与 D＊k卜厂fB结构域们厅伯川川v氮上酸残基位点＠纪果二 1，通过＊C厂力沾，成j川也独川了1）O卜1、DOM和DOb的厂m ill4 l｝［ q卜【I人？Z洲2十研究1毕业论义内认V十厂凹。k卜阿B结构域的友沾、纯化一功能研究结
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R341

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