基于TDI-FP技术的高通量单核苷酸多态性分析系统的建立和初步应用

发布时间：2020-03-23 09:38

【摘要】： TDI-FP技术是一种全新的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)分析技术，它采用荧光偏振(Fluorescence Polarization，FP)为检测手段，是在TDI(Template-directed Dye-terminator Incorporation)法的基础上进一步发展和完善而成。TDI-FP技术具有非常高的特异性和敏感性，而且操作简便，可以实现SNP的自动化和高通量分析。 为了推广TDI-FP技术在我国SNP基础研究和临床疾病相关SNP或者点突变的检测中的应用，该课题利用TDI-FP技术建立了高通量单核苷酸多态性分析系统，并对HBV YMDD基序拉米夫定(LAM)耐药相关点突变进行检测来验正系统的准确性和可行性。 通过YMDD基序定点诱变质粒对高通量单核苷酸多态性分析系统的PCR反应体系和PCR产物消化时间进行优化。该系统的PCR反应体系为： 第四军医大学硕士学位论文 总体积50pl，其中包括10x反应缓冲液5叶二5＊＊。卜L吨CI二3卜1、二．5卜＊。1／L ＊＊＊＊2．＊1、25卜＊。儿引物＊ 和n各0．印I、hq＊＊A聚合酶（SU／pl）O．5“ DNA 模板 … 和 ddHZO 37yi，使得 PCR 反应产物的浓度在 1．18ng／卜l一7刀sng／卜1范困内。为了保证把 5卜IPCR产物中乘u余 dNTPs牙口弓物 完全消化，最终确定至少于 3 7 C孵育 1刀h。 利用该系统对35例PCR阳性的HBV感染者血清进行检测，发现YMDD 野生型26例、YVDD突变型2例、YVDD／YMDD突变混合型二例、YIDD 突变型二例，YIDD／YMDD突变馄合型 1例，其中有两例在 74位 G，。；＋T 的检测结果为阴性，经测序证明，其发生了C741突变型（YIDD）。把PCR产 物与 pGEM丁 Easy载体重组进行测序结果与高通量单核昔酸多态性分析系统 检测结果完全一致，特异性为 100％。山于该系统的敏感性与 PCR反应体系 的敏感性直接相关，所以其敏感性为 92．l％。 山于TDI－FP技术具有非常高的特异性和敏感性，而且操作简便，，可以实 现自动化和高通量检测，因此其在研究病原微生物基因突变、人类基回组单 核昔酸多态性、药物基因组学等方面具有广阔的应用前景。 为了实现高通量单核昔酸多态性分析系统对检测结果的自动化分析，我们 以 Exel作表为依托，用 Visual Basic语言编写软件代码，开发了 HBV DNA 突变高通量单核昔酸多态性分析系统检测软件。该软件主要针对HBV基因组 四个开放读码框的主要点突变进行进行半自动化基因型分析，检测者可以根 据样品的mP值和在散点图中分布，来分析其突变类型。该软件的设计为以 后开发适用于人类单核昔酸多态性完全自动化分析研究软件“ SNP Scorer”打 下了基础。
【学位授予单位】：中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R346

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本文编号：2596541