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甘露聚糖结合凝集素的分离纯化和活性研究

发布时间:2020-03-27 22:43
【摘要】: 研究背景与目的:甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin,MBL),又称甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin,MBL),是一种钙离子依赖的(C型)血清凝集素,在防御抵抗多种病原微生物的天然免疫中起着重要的作用,对6个月到2岁的婴幼儿尤其重要。 MBL是一个由若干个相同的亚单位组成的寡聚体分子,每条肽链的C端是一凝集素结构域(碳水化合物识别结构域),近N端是一胶原样区。这两个结构区与MBL的生物学功能密切相关。其凝集素结构域可以与某些特定的糖配体结合,尤其是与病原微生物表面的糖链结合后,可通过胶原样区激活MBL相关丝氨酸蛋白酶,进而激活补体系统,这条途径称为凝集素途径。MBL也可直接与吞噬细胞表面的胶原凝素受体结合,,发挥调理吞噬功能或引起其它的免疫反应。 正常情况下MBL的血清浓度很低,1.5mg/L左右,但在感染的早期可升高2-3倍。因基因突变而导致的MBL表达水平降低或结构异常,与免疫功能处于不成熟阶段的儿童对感染的易感性增强密切相关。 浙江大学硕土学位论文 本研究旨在用亲和层析法分离纯化出MBL分子,并测定其与单糖配体 以及与儿童临床上常见细菌的结合活性,探讨其在儿童天然免疫中的作用。 方法:将甘露聚糖与漠化氰活化的 SSph。Se 4B偶联,制成亲和柱基质一 甘露聚糖Sopharose 4B。将羊血清或人血浆过亲和柱,在钙离子存在的条件 下,MBL分子可与柱上的甘露聚糖结合。用EDTA通过螫合钙离子,从亲和 柱上洗脱MBL,从而分离纯化出MBL。用还原性10%SDS-PAGE测定羊及 人MBL分子单体的分子量。羊血清MBL经胶原酶消化后,将其产物行还原 性 10%SDS-PAGE,观察 MBL分子量的变化。用酶联凝集素试验测定羊血清 MBL与单糖配体及与常见细菌的结合活性。 结果:①MBL的分离纯化:羊血清与人血浆分别经亲和层析后,得到纯化的 MBL分子。在还原条件下行SDS-PAGE,羊血清MBL在29kD和 33kD及更高分子量处有蛋白质条带;人血浆N旧L在30kD及90 kDkD 处有蛋白质条带; ②MBL分子胶原样结构的鉴定:羊血清MBL分子被胶原酶消化后, 在还原性SDS-PAGE上显示22.4kD及ZI.6kD处有蛋白质条带; ③羊血清MBL与单糖配体的结合活性:羊血清MBL分子对各单糖配 体的结合有一定的选择性,从大到小依次为:N乙酞氨基葡萄糖>卜 岩藻糖>*-氨基葡萄糖>N-乙酚氨基半乳糖; ④羊血清MBL与常见细菌的结合活性:羊血清MBL对不同的细菌有 不同的结合力:对解鸟氨酸克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌有很强的结 合力;对溶血性葡萄球菌、阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌的结合力相 对较弱;对肺炎克雷伯氏菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌的不 同菌株结合力差异较大。 结论:用甘露聚糖石Cpharose 4B亲和柱行亲和层析能从哺乳动物血清(血 .2. 浙江大学硕士学位论文 浆)中分离纯化出有活性的MBL分子,人血浆MBL单体的分子量是30kD, 羊血清MBL单体有两种,分子量分别为29kD和33kD。羊血清MBL分子与 其它哺乳动物的MBL分子一样,也具有胶原样结构域。羊血清MBL对各种 单糖的结合有不同的选择性,其选择性与人血浆MBL类似。羊血清MBL 对不同的细菌有不同的结合力,对革兰氏阴性菌的结合力相对较阳性菌强。
【图文】:

胶原酶,蛋白质,条带,还原性


2.2MBL分子胶原样结构的鉴定羊血清MBL在37℃与Vn型胶原酶孵育24小时后,行还原性10%SDS一PAGE,结果如图3所示。在第1泳道可见胶原酶在12OkD及111kD处有蛋白质条带显示。在第3泳道可见经胶原酶消化后的蛋白质在22.4kD、21.6kD低分子量处有条带显示。
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R341

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 陈政良,韩强涛,易正山,张丽芸,卢晓,彭良平;人血浆MBL的分离纯化及其特性鉴定[J];免疫学杂志;1998年01期



本文编号:2603496

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