hJaggedl～（ext）-Fc融合蛋白真核表达载体的构建和表达

发布时间：2020-03-28 08:56

【摘要】：研究背景造血干细胞移植是治疗恶性血液病、再生障碍性贫血、实体瘤、免疫缺陷病和重度急性放射病的有效方法。然而，由于造血干细胞的来源的限制，半数以上的患者仍无法接受该项治疗。随着干细胞生物工程的发展，人们试图通过体外扩增造血干／祖细胞以满足临床的需求。传统的造血干／祖细胞的体外扩增方法，大多局限于几种造血因子如IL-3，IL-6，SCF，EPO等细胞因子的联合应用，在体外刺激造血干细胞的扩增。实验证明，在这种培养体系中培养的造血干／祖细胞，其自我更新的能力逐渐减弱，更容易分化为某种特定的成熟细胞，难以获得足够的重建造血的干细胞数量。因此，如何模拟体内造血微环境，实现造血干／祖细胞的体外扩增，在理论及临床应用上都具有重要的意义。造血干细胞是一群存在于造血组织，具有自我更新及定向分化潜能的造血细胞，目前，对于造血干细胞的增殖及分化的分子调节机制尚不完全清楚，认为可能是通过细胞因子及细胞与细胞之间的相互接触来发挥调节作用。Notch信号途径在生物进化中高度保守，主要调控细胞的分化方向，它广泛存在于多种生物体内，从果蝇、线虫到人类，与多种细胞、组织、器官第四军医大学硕士学位论文的生长发育有关，Jaggedl作为Notch的配体，它由1218个氨基酸组成，，是I型跨膜蛋白，其胞外段含有16个EGF(EPid~al Grov改h Factor)样重复序列，并含有一个富含半胧氨酸的DSL (Delta一serra1Le一Lag一2)基序(motif)，这一基序在与Notch的相互作用中起关键作用。近来发现，人造血干/祖细胞表面存在 Notch受体的表达，而在骨髓基质细胞表面存在Ja留edl的表达，提示Notoh信号途径可能对造血干/祖细胞的自我更新与增殖起重要作用，有研究表明Notch可以抑制造血干/祖细胞的分化，但是能够促进其增殖。实验目的为了进一步研究Jaggedl在造血干/祖细胞的体外扩增中的作用，构建含人Jaggedl胞外段一IgFc融合基因片段的质粒，并在真核细胞中表达。实验方法从正常人的骨髓细胞中提取总RNA，根据GenBank中人Jaggedl基因的碱基序列，按照引物设计原则，针对Jaggedl基因的胞外段设计引物。并经RT一PCR扩增出Jaggedl基因的胞外段编码序列，测序结果证实与文献报道完全一致;将Jaggedl基因的胞外段插入到融合有人IgGIFc基因组片段的克隆载体 PBluescriPt SKll中，以获得hjaggedl‘一Fc融合基因。将 hjaggedl‘对一Fc融合基因定向插入真核表达载体pEF一BOSne。中，构建重组真核表达载体PEF一BOSne。一hjaggedl叭Fc;瞬时转染 COs7细胞后，再次利用RT一PCR技术在转录水平对hjaggedl喇一Fc 融合基因的表达情况进行检测;直接免疫荧光检测Uaggedl喇一c 融合蛋白在COS7细胞中的表达，夹心ELISA检测细胞培养上清中hjag罗dl晚一Fc融合蛋白的分泌表达情况。以醉F一OSne。- hJ昭g刃l’爪一Fc质粒稳定转染X63细胞，建立稳定表达hjaggedl叭 Fc融合蛋白的细胞株，ELISA检测hjaggedl叹Fc融合蛋白的表达效率。第四军医大学硕士学位论文实验结果hjaggedl的胞外段被有效的扩增，DNA序列分析表明所构建的含hjaggedlext一Fc融合基因的质粒与预期设计相同， hjaggedl砚一Fc融合蛋白得到正确的表达。X63稳定表达细胞株 hjaggedlext一Fc融合蛋白的分泌表达量为3拌留扣工。实脸讨论本研究成功地构建了真核表达载体pEF一OSneo一hjag .gedl一Fc，并初步证实hjaggedi砚一Fc融合蛋白能够在真核细胞中分泌表达。这一结果为下一步以hJ昭gedl的胞外段为刺激物，联合应用不同的造血刺激因子，观察对体外扩增的造血千/祖细胞在数量及其生物学功能方面的影响，为解决临床移植及基因治疗的干细胞来源问题奠定了基础。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

【参考文献】