细菌内同源重组法构建含融合自杀基因CDglyTK的重组腺病毒

发布时间：2020-03-28 11:14

【摘要】：单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(EC-CD)基因是VDEPT系统中两种研究最深入，应用最广泛的自杀基因，，基因序列及其表达产物的作用机制已基本明确。本研究将二者构建成融合自杀基因CDglyTK，采用细菌内同源重组法，以复制缺陷型腺病毒为载体导入真核包装细胞系293细胞中，成功构建了含双自杀基因的重组腺病毒，以期获得较单自杀基因具有更高抗肿瘤疗效的生物治疗制剂。本研究首先从质粒pBlueScript-CD中PCR扩增出带有酶切识别位点的EC-CD基因片段，利用PCR产物两末端带有的单个A碱基，与带有单个T碱基末端的PMD18-T载体借助碱基互补相连接，构建成质粒PMD18-T-CD。从该质粒中切下EC-CD片段，与带有相同粘性末端的穿梭质粒pAdTrack-CMV构建成pAdTrack-CMV-CD，并进行了PCR和酶切鉴定。HSV-TK基因自质粒pAdE1CMV-TK中经PCR扩增获取，并通过设计引物使之5’端带有编码甘氨酸的寡核苷酸链，最终获得glyTK。glyTK基因和质粒pAdTrack-CMV-CD经酶切、连接构建成含融合自杀基因的穿梭质粒pAdTrack-CMV-CDglyTK，并采用PCR扩增、酶切以及对插入片断进行测序这三种方法进行鉴定。重组腺病毒质粒的构建采用了细菌内同源重组法，将经Pme Ⅰ酶切线性化的穿梭质粒pAdTrack-CMV-CDglyTK和带有腺病毒主要基因组的骨架质天津医科大学硕士研究生学位论文粒pAdEasy一l共同转化至具有高同源重组能力的BJS 183菌中，病毒质粒pAdEasy一GFP一CDglyTK。经卡那霉素初筛、酶切和构建成重组腺 PCR鉴定正确后，再将其转化至DHS。菌中，以获取足量拷贝的重组质粒。用脂质体法将其转染293细胞，包装、扩增出含融合自杀基因的重组腺病毒rAd一CDglyTK，从而为进一步用于恶性肿瘤基因治疗的体内、外实验研究以及最终的临床应用奠定了坚实的基础。另外，在构建重组腺病毒rAd一CDglyTK时，本研究从方法学上进行了较为深入的探讨，对所选用的AdEasy系统进行了改进。既可使该系统不需再借助昂贵的仪器，进而实现在一般性实验室内进行质粒的细菌内重组，节省了财力，扩大了应用范围;同时也保证了较高的细菌内同源重组的成功率。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

【参考文献】